癲癇伴抑郁大鼠杏仁核腦源性神經營養因子及其受體酪氨酸激酶受體B的表達觀察

楊鈞哲,許新煒,朱含笑,程莉晶,李云

(1大理大學臨床醫學院,云南大理 671000;2大理大學第一附屬醫院)

癲癇伴發抑郁(EAD)是一種常見的神經精神疾病。癲癇是神經系統常見的疾病，抑郁是現代社會較為嚴重的精神問題。EAD發病率呈逐年遞增趨勢，癲癇發作程度及其所造成的損傷是導致抑郁發生的重要危險因素[1]。抑郁嚴重影響了癲癇患者的日常生活及社會功能，也給家庭及社會帶來了沉重的經濟負擔。已有研究認為，癲癇和抑郁存在潛在共同發病機制，但其具體發病機制目前尚不清楚。因此，積極探索該病的發病機制及相關因素至關重要，對臨床有效防治EAD具有重要意義。腦源性神經營養因子(BDNF)是神經生長因子家族的重要成員，在中樞神經系統許多區域表達，通過與其特異性高親和力受體酪氨酸激酶受體B(TrkB)結合，發揮較強的促進神經細胞生長、分化、維持神經細胞存活和正常生理功能的作用[2]。BDNF及其受體TrkB參與損傷神經元的再生、發育，并參與突觸重塑和神經遞質傳遞的功能；BDNF能夠影響成熟神經元的興奮性，癲癇過程中BDNF水平明顯上調，提示BDNF可能在癲癇發生機制中具有重要作用[2，3]。有研究發現，抗抑郁藥物可以提高BDNF水平、促進神經元再生，并增加神經元突觸的可塑性來發揮抗抑郁作用，改善抑郁患者的臨床癥狀，提示BDNF及其受體TrkB在抑郁癥的發生、發展及轉歸中發揮了不可替代的作用。本課題組前期的研究[3]發現，BDNF及其受體TrkB在腦卒中后抑郁發病中具有重要作用。現有研究提示，BDNF在癲癇及抑郁發病中均有作用，但其在EAD發病中的作用尚未見文獻報道。2017年12月～2018年4月，我們觀察了EAD大鼠杏仁核BDNF及其受體TrkB蛋白表達的變化，以探討二者與EAD發病的關系。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 健康清潔級成年雌性SD大鼠52只，體質量(250±50)g,由昆明醫科大學動物實驗中心提供，動物質量合格證：SYXK(滇)2005-0004。實驗過程中對動物的處置符合大理大學第一附屬醫院關于使用實驗動物的倫理學標準。Western blotting試劑：兔抗鼠β-actin 1∶1 500(一抗)、兔抗鼠抗體BDNF 1∶500(一抗)、兔抗鼠抗體TrkB 1∶1 000(一抗)、羊抗兔IgG抗體1∶500(第二抗),均購自CST公司；ECL試劑盒購自福建博特生物科技有限公司。免疫組化實驗試劑BDNF及TrkB兔抗單克隆抗體購自Abcam公司；熒光二抗DylightTM594標記的羊抗兔IgG(發紅色熒光)購自KPL公司。

1.2 動物分組及EAD模型建立、鑒定 采用Open-field法將健康成年SD大鼠52只隨機分為對照組、癲癇組、抑郁組和EAD組，每組13只。抑郁組：采用慢性不可預見的中等應激刺激(CUMS)結合孤養法建立大鼠慢性應激抑郁模型。癲癇組采用文獻[3]方法建立氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型，癲癇發作行為評分采用Racine評分標準：0級：未有任何反應；Ⅰ級：面部抽搐，包括節奏性咀嚼、動須等；Ⅱ級：在Ⅰ級的基礎上加節律性點頭動作；Ⅲ級：在Ⅱ級的基礎上加前肢肌陣攣發作，但無后肢直立位；Ⅳ級：在Ⅲ級基礎上加后肢直立位；Ⅴ級：全面性強直—陣攣發作，肢體失去控制。大鼠出現Ⅳ級以上的癲癇大發作為癲癇造模成功標準。于造模后第14天對癲癇模型進行抑郁篩選，EAD大鼠為EAD組，癲癇未伴抑郁者為癲癇組。EAD造模成功標準：大鼠出現Ⅳ級以上的發作時間大于60 min以上，大鼠毛發明顯失去光澤，體質量減輕，蜷縮活動減少，自發活動和探究性活動減少，提示EAD模型建立成功。對照組：大鼠常規飼養。在造模成功后第1、8、15、29天，監測4組大鼠體質量、進行蔗糖水消耗實驗及曠場實驗進行抑郁行為評價。蔗糖水試驗：各組大鼠在造模后第1、8、15、29天，每隔1周進行禁水24 h，測定禁水24 h后的第1 h內動物飲用1%蔗糖溶液的量(蔗糖溶液的飲用量反映了大鼠對獎賞的快感反應)。曠野試驗：擬用敞箱長寬均為100 cm、高為50 cm，內空的立柱體，壁周為黑色，地面用黑線劃分為面積相等的25塊。以動物穿越地面方塊數(四爪跨入)作為水平活動得分(反映大鼠的運動活動性水平)，以直立次數(兩前肢離地1 cm以上)為垂直活動得分(反映其興趣減少程度)。行為學評價結果顯示：各組大鼠CUMS前、后不同時間體質量比較，EAD組、抑郁組與對照組、癲癇組相比較，在CUMS后第29天，肉眼觀大鼠體型瘦弱，體毛失去光澤，蜷縮少動，快感缺乏，自發性探究活動減少。應激后不同時間各組大鼠體質量、蔗糖溶液消耗量、曠場實驗水平運動距離及垂直運動距離比較大鼠體質量減少、蔗糖溶液消耗量降低、大鼠曠場實驗水平運動距離、垂直運動距離縮短(P均<0.05);在CUMS后第29天，抑郁組、EAD組大鼠以上各指標較CUMS后1、8、15天降低(P均<0.05)，詳見表1，進一步說明EAD模型建立成功。

1.3 各組大鼠杏仁核BDNF及TrkB蛋白的檢測 各組大鼠分別于造模成功后第29天取材，采用活體灌注取腦法取腦組織。①免疫熒光染色法檢測杏仁核BDNF及TrkB蛋白：每組取8只大鼠，用3.6%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔麻醉，用生理鹽水從左心室灌洗后，灌注4%多聚甲醛，斷頭取腦，于冠狀面上切取大鼠大腦杏仁核0.5 cm，用冰凍石蠟切片機連續冠狀切片，片厚8 μm，切片放于0.1 MPBS中浸泡固定24 h備用。按試劑盒說明書步驟操作，最后采用激光共聚焦微鏡拍照，在每只動物杏仁核區選擇高倍視野(HPF，400X)，計數BDNF和TrkB陽性細胞數量。②Western blotting法檢測杏仁核BDNF及TrkB蛋白：每組取5只大鼠，麻醉后迅速活體取腦，根據大鼠解剖立體定向圖譜于冠狀位上切取0.5 cm厚的杏仁核約100 mg，置EP管中，-80 ℃冰箱保存。按試劑盒說明書步驟進行操作，最后計算條帶的積分吸光度(IOD)值表示BDNF及TrkB蛋白相對表達量。

表1 各組大鼠不同時間體質量、蔗糖溶液消耗量、曠場實驗水平運動距離及垂直運動距離比較

注：與對照組同時間比較，▲P<0.05；與癲癇組同時間比較，▽P<0.05。

2 結果

各組大鼠BDNF和TrkB陽性細胞發紅色熒光，BDNF陽性產物定位在神經元胞質及突起根部，細胞核無染色；TrkB陽性細胞產物定位在神經元胞質，細胞核無染色。與對照組和癲癇組比較，EAD組大鼠杏仁核BDNF和TrkB陽性細胞數減少(P均<0.05)，見表1。與對照組和癲癇組相比，EAD組杏仁核BDNF及TrkB蛋白表達量減少(P均<0.05)，見表2。

3 討論

杏仁核結構功能復雜、纖維聯系廣泛，參與了情感行為的形成、內分泌整合過程，其結構及功能改變與抑郁情緒的產生關系密切[4～6]。抑郁患者存在杏仁核容積縮小[4]，EAD模型大鼠杏仁核存在明顯的神經元凋亡，可見杏仁核與EAD發生關系密切。近年研究發現，EAD的作用機制可能與神經突觸可塑性異常有關。BDNF為一種重要的營養神經細胞的蛋白質，主要存在于海馬、皮質下、杏仁核組織。BDNF對神經元的分化、修復以及再生具有重要作用，其可以通過與TrkB結合發揮生物學功能作用，如改善突觸可塑性、使受損傷后神經元再生及參與認知、學習、情緒等方面的功能調節等。BDNF可長期調節中樞神經系統的突觸可塑性：一方面，BDNF能增加Ras同源基因家族成員A(RhoA)蛋白水平,而RhoA可促進肌動蛋白細胞骨架的重組和樹突蛋白的合成,調節突觸可塑性[7]；另一方面,BDNF可調節海馬神經元及突觸中的蛋白酶體活性,從而使突觸內的蛋白質處于相對平衡狀態,以此來調節中樞神經系統突觸可塑性[8]。TrkB是BDNF的高親和力受體，廣泛存在于神經系統中，參與神經元生長、發育過程，引起突觸傳遞及可塑性調節。杏仁核中BDNF及其受體TrkB是否在EAD中發揮作用未見相關報道。

表1 各組大鼠杏仁核BDNF及TrkB陽性細胞數 比較(個/視野，

注：與對照組對比，aP<0.05；與癲癇組對比，bP<0.05。

表2 各組大鼠杏仁核BDNF及TrkB蛋白相對表達量 比較

注：與對照組對比，aP<0.05；與癲癇組對比，bP<0.05。

BDNF與抑郁癥的發生存在著關聯。研究[3]顯示，抑郁癥患者杏仁核中BDNF的高親和力受體TrkB明顯降低。動物實驗結果[9]顯示，TrkB激動劑可明顯改善由脂多糖導致的大鼠海馬區CA3結構區損傷、減少杏仁核p-TrkB表達、下調樹突密度，從而發揮抗抑郁作用。鄭蕾等[10]研究發現，母愛剝奪的成年大鼠海馬和杏仁核BDNF及TrkB蛋白水平下降，導致了應激相關的抑郁癥狀發生。臨床一線抗抑郁藥物可以通過提高BDNF水平促進神經元再生，并增加神經元突觸的可塑性來發揮治療效果，從而改善患者的臨床癥狀。本研究結果顯示，與對照組比較，抑郁組及EAD組杏仁核BDNF及TrkB表達均低于對照組，抑郁組與EAD組BDNF、TrkB比較差異無統計學意義，提示在抑郁大鼠中杏仁核BDNF、TrkB表達降低，且杏仁核BDNF、TrkB降低也可能提示EAD的發生。

BDNF及其受體TrkB在癲癇發病機制中發揮著重要作用。BDNF能使神經元產生興奮，癲癇過程中BDNF水平明顯升高[11]。在癲癇杏仁核結構中，顆粒細胞BDNF蛋白表達明顯上調，而且BDNF受體TrkB蛋白表達也增加[12，13]。文獻[14]報道，BDNF與苔癬纖維出芽(MFS)的關系密切，直接注射BDNF于成年大鼠腦內(海馬、杏仁核、額前皮質等)可以誘發MFS，從而使大鼠出現癲癇樣癥狀；癲癇可促使腦組織中苔蘚纖維BDNF上調。通過過度刺激L型鈣通道，可以引起顆粒細胞表達BDNF，激活TrkB受體可以引起腦內(海馬、杏仁核、額前皮質等)MFS現象，從而誘發癲癇發作[15]。本研究結果顯示，與對照組比較，癲癇組杏仁核BDNF、TrkB表達升高，EAD組杏仁核BDNF、TrkB表達降低，提示癲癇大鼠中杏仁核BDNF、TrkB表達升高，二者表達降低可能預示EAD的發生。

總之，與癲癇大鼠比較，EAD大鼠杏仁核BDNF及TrkB表達均降低，二者表達降低可能提示EAD發生。但本研究樣本量少，后續研究需進一步擴大樣本量，以進一步驗證此結論。