野核桃青皮中胡桃醌含量測定及抗菌活性研究

楊霞，趙玉雪，朱佳敏，吳柳燕，黃安香

(1.貴州省核桃研究所，貴州 貴陽 550005；2.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550005)

野核桃是胡桃科胡桃屬的落葉喬木，主要分布在我國的西北、西南等多個省份，在貴州很多地方都有分布，主要集中在六盤水、黔東南、遵義和銅仁等地區(qū)[1-2]。野核桃的果實堅硬，不易取仁，適宜在工藝品方面進(jìn)行開發(fā)利用，而其木材較為優(yōu)良，材用價值較高。目前對于野核桃的研究包括：資源現(xiàn)狀分析[3-4]、種群統(tǒng)計、果的表型及生長特性方面[5-8]，在化學(xué)成分方面，對野核桃根皮、葉片的主要化學(xué)成分及野核桃殼中的元素進(jìn)行了測定[9-11]，但是關(guān)于野核桃青皮化學(xué)成分及抗菌活性的研究仍然未見報道。

本研究擬通過高效液相色譜對貴州野核桃青皮中胡桃醌含量進(jìn)行測定，并測定胡桃醌對5種植物病原菌的抗菌活性，為野核桃資源的分析和利用提供一定理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于99%)；甲醇，色譜純；超純水(娃哈哈公司)；醋酸，分析純；野核桃青皮，采自貴州省盤州市松河鄉(xiāng)；云南泡核桃青皮，采自貴州省正安縣瑞溪鎮(zhèn)；本地泡核桃青皮，采自貴州省息烽縣西山鎮(zhèn)(核桃青皮樣品經(jīng)70 ℃烘干后粉碎成粉末備用)；供試菌株有含笑枝枯病(Botryosphaeriadothidea)、西康玉蘭根腐(Fusariumoxysporum)、馬尾松潰瘍病(Sphaeropsissapinea)、核桃枝枯病(PhomopsisvacciniiShear)、山茶立枯病(Rhizoctoniasolani)由貴州省林科院森保所分離鑒定。

Agilent 1220 高效液相色譜系統(tǒng)(紫外檢測器、二元泵溶劑系統(tǒng)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、Chemstation工作站)；色譜柱Geminu 5U C18110 A (250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 色譜條件[12]

設(shè)置紫外檢測器(HPLC-VWD)的最大吸收波長為250 nm，使用Geminu 5U C18110A (250 mm×4.6 mm，5 μm)反相色譜柱，色譜柱溫度30 ℃。緩沖液為甲醇(A)∶1%醋酸水溶液(B)=55∶45(體積比)，緩沖液流速0.8 mL/min，總進(jìn)樣時間20 min，樣品進(jìn)樣量為10 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 用200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液配制成 3，5，8，10，15，50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，按照1.2節(jié)所述方法進(jìn)行檢測。每個濃度3次重復(fù)。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積平均值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of juglone

1.4 樣品提取

稱取干燥的野核桃青皮粉末4 g于三角燒瓶中，加入60 mL無水乙醇，在35 ℃、100 W條件下超聲1 h，抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至梨形瓶中旋蒸，然后加入200 mL甲醇，進(jìn)行溶解，取2 mL過0.45 μm的濾膜于試劑瓶中，待HPLC檢測。

1.5 胡桃醌對不同植物病原菌抑制效果初篩

對5種病菌：含笑枝枯病(Botryosphaeriadothidea)、西康玉蘭根腐病(Fusariumoxysporum)、馬尾松潰瘍病(Sphaeropsissapinea)、核桃枝枯病(PhomopsisvacciniiShear)、山茶立枯病(Rhizoctoniasolani)進(jìn)行初步抑菌活性測定，用甲醇將胡桃醌配制成濃度為200 mg/L的藥液，采用平板生長法[11]測定胡桃醌的抑菌活性。每個病菌設(shè)置3個重復(fù)，并設(shè)置溶劑對照，計算抑制率。

抑制率=

1.6 胡桃醌對兩種植物病原菌的毒力測定

初篩后胡桃醌抑制效果較好的病菌為馬尾松潰瘍(Sphaeropsissapinea)和核桃枝枯病(PhomopsisvacciniiShear)，對這兩種病菌分別進(jìn)行EC50值的測定：設(shè)計5個質(zhì)量濃度梯度200，160，120，80，40 mg/L，采用1.5節(jié)的方法測定各個處理下菌絲的增長情況，并且計算抑制率。對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程y=ax+b及線性相關(guān)系數(shù)r，分別計算胡桃醌對病原菌的EC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

在流動相緩沖液為甲醇(A)∶1%醋酸水溶液(B)=55∶45(體積比)，色譜柱溫度30 ℃，流速為0.8 mL/min時，能夠較好分離樣品的目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰，樣品出峰時間為12.66 min。得到的色譜圖見圖2。

圖2 胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品(A)及野核桃青皮樣品(B)的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of juglone andJugians cathayensis Dode sample

2.2 提取條件優(yōu)化

2.2.1 提取方式 分別以冷浸24 h、回流1 h、超聲30 min的方式進(jìn)行胡桃醌提取。回流法、超聲法和冷浸法的收率見圖3a。

由圖3a可知，以加熱回流提取1 h，平均收率為82.80%；超聲30 min，平均收率為81.94%；冷浸24 h，平均收率為49.5%。加熱回流法的收率略大于超聲法的收率，但考慮加熱回流耗時較長，操作復(fù)雜，雜質(zhì)干擾較大，且溫度過高會導(dǎo)致胡桃醌降解等因素，采用超聲法進(jìn)行提取較為適宜。

對于一些常無ASF疫病暴發(fā)的國家與區(qū)域，還需要做好生豬以及相關(guān)產(chǎn)品的管理工作。ASF作為一種擴(kuò)散性疾病，一旦爆發(fā)還會造成非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，對于該區(qū)域的養(yǎng)殖效益與經(jīng)濟(jì)效益還會產(chǎn)生巨大的威脅，這也就要求各國家能做好ASF的預(yù)防工作，促進(jìn)自身的養(yǎng)殖行業(yè)得到進(jìn)一步的發(fā)展。各級政府部門需要加強(qiáng)對診斷試劑以及疫苗生產(chǎn)的研究與儲備工作，不得從有疫病的國家中進(jìn)行生豬、豬飼料以及豬肉相關(guān)產(chǎn)品的進(jìn)口工作，并需要在海關(guān)等單位做好生物安全防護(hù)措施[2]。

2.2.2 提取液料比 按照料液比1∶8，1∶15，1∶20 g/mL(青皮質(zhì)量∶乙醇)超聲提取30 min，結(jié)果見圖3b。

由圖3b可知，料液比增加時，平均收率先升后降，料液比1∶15 g/mL時收率最高，且乙醇的用量也較為合理。

2.2.3 提取時間 由圖3c可知，提取時間1 h時，收率最高。

2.2.4 提取溫度 由圖3d可知，隨溫度升高，胡桃醌的收率先升后降，溫度35 ℃時，胡桃醌的收率最高，可能溫度過高導(dǎo)致胡桃醌降解。因此，35 ℃為最佳提取溫度。

圖3 胡桃醌提取條件優(yōu)化Fig.3 Optimized the extracting conditions of juglone

2.3 回收率穩(wěn)定性驗證

分別在野核桃青皮樣品中加入胡桃醌標(biāo)樣5，10，15 μg，按照1.4節(jié)的方法進(jìn)行處理，每個濃度做5個平行，測定其回收率，結(jié)果見表1。

表1 三個添加水平的野核桃青皮中胡桃醌的回收率(n=5)Table 1 Recovery rates and RSD values of juglone inJugians cathayensis Dode at three spiked levels

注：①4 g中野核桃青皮胡桃醌的含量；②回收率的平均值。

由表1可知，添加回收率的范圍為70%～120%，RSD<10%。因此，該方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性較好。

2.4 樣品分析

分別測定了盤州市野核桃青皮、正安縣云南泡核桃青皮和息烽縣本地泡核桃青皮中胡桃醌的含量，結(jié)果見表2。

表2 不同品種核桃青皮中胡桃醌含量(n=3)Table 2 The content of juglone in the peel ofdifferent walnut varieties

由表2可知，本地野核桃青皮中胡桃醌含量最高，為0.84 mg/g，本地泡核桃青皮胡桃醌含量為0.53 mg/g，云南泡核桃青皮中胡桃醌含量為 0.41 mg/g。

2.5 胡桃醌對不同植物病原菌抑制效果初篩

200 mg/L的胡桃醌溶液對含笑枝枯病(Botryosphaeriadothidea)、西康玉蘭根腐(Fusariumoxysporum)、馬尾松潰瘍病(Sphaeropsissapinea)、核桃枝枯病(PhomopsisvacciniiShear)、山茶立枯病(Rhizoctoniasolani)的抑制率分別為：29.24%，46.57%，83.39%，66.79%，27.44%(見表3)。其中胡桃醌對馬尾松潰瘍病和核桃枝枯病的抑制效果較好。

表3 胡桃醌對不同植物病菌的抑菌效果初篩Table 3 The inhibitory effect of juglone ondifferent plant pathogen

2.6 胡桃醌對兩種植物病原菌的毒力測定

測定初篩效果較好的2種病原菌馬尾松潰瘍病(Sphaeropsissapinea)和核桃枝枯病(PhomopsisvacciniiShear)的EC50值，結(jié)果見表4。

表4 胡桃醌對兩種植物病原菌的毒力測定Table 4 The virulence test of jugloneagainst two plant pathogen

由表4可知，胡桃醌對馬尾松潰瘍病菌的EC50為102.751 mg/L，對核桃枝枯病的EC50為112.808 mg/L。

3 結(jié)論

(1)核桃青皮中胡桃醌的最佳提取條件為：超聲100 W 1 h，提取溫度35 ℃，液料比1∶15 g/mL。在此條件下，提取率達(dá)到90%以上。超聲法提取青皮中胡桃醌，提取時間短，且操作簡單。

(2)采用HLCP檢測胡桃醌的含量，可以有效地分離出目標(biāo)與雜質(zhì)。檢測的胡桃醌回收率在80.66%～109.21%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差R2<10%，說明該方法適用于野核桃青皮中胡桃醌含量的檢測。

(3)本地野核桃青皮中胡桃醌含量為0.84 mg/g，高于本地泡核桃和云南泡核桃。

(4)胡桃醌對馬尾松潰瘍病菌和核桃枝枯病菌的抑制效果較好，EC50值分別為102.751 mg/L和112.808 mg/L。表明野核桃青皮具有一定的農(nóng)藥開發(fā)價值。