野核桃青皮中胡桃醌含量測定及抗菌活性研究

楊霞，趙玉雪，朱佳敏，吳柳燕，黃安香

(1.貴州省核桃研究所，貴州 貴陽 550005；2.貴州省林業科學研究院，貴州 貴陽 550005)

野核桃是胡桃科胡桃屬的落葉喬木，主要分布在我國的西北、西南等多個省份，在貴州很多地方都有分布，主要集中在六盤水、黔東南、遵義和銅仁等地區[1-2]。野核桃的果實堅硬，不易取仁，適宜在工藝品方面進行開發利用，而其木材較為優良，材用價值較高。目前對于野核桃的研究包括：資源現狀分析[3-4]、種群統計、果的表型及生長特性方面[5-8]，在化學成分方面，對野核桃根皮、葉片的主要化學成分及野核桃殼中的元素進行了測定[9-11]，但是關于野核桃青皮化學成分及抗菌活性的研究仍然未見報道。

本研究擬通過高效液相色譜對貴州野核桃青皮中胡桃醌含量進行測定，并測定胡桃醌對5種植物病原菌的抗菌活性，為野核桃資源的分析和利用提供一定理論依據。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

胡桃醌標準品(純度大于99%)；甲醇，色譜純；超純水(娃哈哈公司)；醋酸，分析純；野核桃青皮，采自貴州省盤州市松河鄉；云南泡核桃青皮，采自貴州省正安縣瑞溪鎮；本地泡核桃青皮，采自貴州省息烽縣西山鎮(核桃青皮樣品經70 ℃烘干后粉碎成粉末備用)；供試菌株有含笑枝枯病(Botryosphaeriadothidea)、西康玉蘭根腐(Fusariumoxysporum)、馬尾松潰瘍病(Sphaeropsissapinea)、核桃枝枯病(PhomopsisvacciniiShear)、山茶立枯病(Rhizoctoniasolani)由貴州省林科院森保所分離鑒定。

Agilent 1220 高效液相色譜系統(紫外檢測器、二元泵溶劑系統、自動進樣器、柱溫箱、Chemstation工作站)；色譜柱Geminu 5U C18110 A (250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 色譜條件[12]

設置紫外檢測器(HPLC-VWD)的最大吸收波長為250 nm，使用Geminu 5U C18110A (250 mm×4.6 mm，5 μm)反相色譜柱，色譜柱溫度30 ℃。緩沖液為甲醇(A)∶1%醋酸水溶液(B)=55∶45(體積比)，緩沖液流速0.8 mL/min，總進樣時間20 min，樣品進樣量為10 μL。

1.3 標準曲線繪制

1.3.2 標準曲線繪制 用200 μg/mL的標準母液配制成 3，5，8，10，15，50 μg/mL的標準液，按照1.2節所述方法進行檢測。每個濃度3次重復。以濃度為橫坐標，峰面積平均值為縱坐標繪制標準曲線，見圖1。

圖1 胡桃醌標準曲線Fig.1 The standard curve of juglone

1.4 樣品提取

稱取干燥的野核桃青皮粉末4 g于三角燒瓶中，加入60 mL無水乙醇，在35 ℃、100 W條件下超聲1 h，抽濾，濾液轉移至梨形瓶中旋蒸，然后加入200 mL甲醇，進行溶解，取2 mL過0.45 μm的濾膜于試劑瓶中，待HPLC檢測。

1.5 胡桃醌對不同植物病原菌抑制效果初篩

對5種病菌：含笑枝枯病(Botryosphaeriadothidea)、西康玉蘭根腐病(Fusariumoxysporum)、馬尾松潰瘍病(Sphaeropsissapinea)、核桃枝枯病(PhomopsisvacciniiShear)、山茶立枯病(Rhizoctoniasolani)進行初步抑菌活性測定，用甲醇將胡桃醌配制成濃度為200 mg/L的藥液，采用平板生長法[11]測定胡桃醌的抑菌活性。每個病菌設置3個重復，并設置溶劑對照，計算抑制率。

抑制率=

1.6 胡桃醌對兩種植物病原菌的毒力測定

初篩后胡桃醌抑制效果較好的病菌為馬尾松潰瘍(Sphaeropsissapinea)和核桃枝枯病(PhomopsisvacciniiShear)，對這兩種病菌分別進行EC50值的測定：設計5個質量濃度梯度200，160，120，80，40 mg/L，采用1.5節的方法測定各個處理下菌絲的增長情況，并且計算抑制率。對所得數據進行回歸分析，得回歸方程y=ax+b及線性相關系數r，分別計算胡桃醌對病原菌的EC50值。

2 結果與討論

2.1 色譜條件

在流動相緩沖液為甲醇(A)∶1%醋酸水溶液(B)=55∶45(體積比)，色譜柱溫度30 ℃，流速為0.8 mL/min時，能夠較好分離樣品的目標峰和雜質峰，樣品出峰時間為12.66 min。得到的色譜圖見圖2。

圖2 胡桃醌標準品(A)及野核桃青皮樣品(B)的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of juglone andJugians cathayensis Dode sample

2.2 提取條件優化

2.2.1 提取方式 分別以冷浸24 h、回流1 h、超聲30 min的方式進行胡桃醌提取。回流法、超聲法和冷浸法的收率見圖3a。

由圖3a可知，以加熱回流提取1 h，平均收率為82.80%；超聲30 min，平均收率為81.94%；冷浸24 h，平均收率為49.5%。加熱回流法的收率略大于超聲法的收率，但考慮加熱回流耗時較長，操作復雜，雜質干擾較大，且溫度過高會導致胡桃醌降解等因素，采用超聲法進行提取較為適宜。

對于一些常無ASF疫病暴發的國家與區域，還需要做好生豬以及相關產品的管理工作。ASF作為一種擴散性疾病，一旦爆發還會造成非常嚴重的經濟損失，對于該區域的養殖效益與經濟效益還會產生巨大的威脅，這也就要求各國家能做好ASF的預防工作，促進自身的養殖行業得到進一步的發展。各級政府部門需要加強對診斷試劑以及疫苗生產的研究與儲備工作，不得從有疫病的國家中進行生豬、豬飼料以及豬肉相關產品的進口工作，并需要在海關等單位做好生物安全防護措施[2]。

2.2.2 提取液料比 按照料液比1∶8，1∶15，1∶20 g/mL(青皮質量∶乙醇)超聲提取30 min，結果見圖3b。

由圖3b可知，料液比增加時，平均收率先升后降，料液比1∶15 g/mL時收率最高，且乙醇的用量也較為合理。

2.2.3 提取時間 由圖3c可知，提取時間1 h時，收率最高。

2.2.4 提取溫度 由圖3d可知，隨溫度升高，胡桃醌的收率先升后降，溫度35 ℃時，胡桃醌的收率最高，可能溫度過高導致胡桃醌降解。因此，35 ℃為最佳提取溫度。

圖3 胡桃醌提取條件優化Fig.3 Optimized the extracting conditions of juglone

2.3 回收率穩定性驗證

分別在野核桃青皮樣品中加入胡桃醌標樣5，10，15 μg，按照1.4節的方法進行處理，每個濃度做5個平行，測定其回收率，結果見表1。

表1 三個添加水平的野核桃青皮中胡桃醌的回收率(n=5)Table 1 Recovery rates and RSD values of juglone inJugians cathayensis Dode at three spiked levels

注：①4 g中野核桃青皮胡桃醌的含量；②回收率的平均值。

由表1可知，添加回收率的范圍為70%～120%，RSD<10%。因此，該方法的穩定性和準確性較好。

2.4 樣品分析

分別測定了盤州市野核桃青皮、正安縣云南泡核桃青皮和息烽縣本地泡核桃青皮中胡桃醌的含量，結果見表2。

表2 不同品種核桃青皮中胡桃醌含量(n=3)Table 2 The content of juglone in the peel ofdifferent walnut varieties

由表2可知，本地野核桃青皮中胡桃醌含量最高，為0.84 mg/g，本地泡核桃青皮胡桃醌含量為0.53 mg/g，云南泡核桃青皮中胡桃醌含量為 0.41 mg/g。

2.5 胡桃醌對不同植物病原菌抑制效果初篩

200 mg/L的胡桃醌溶液對含笑枝枯病(Botryosphaeriadothidea)、西康玉蘭根腐(Fusariumoxysporum)、馬尾松潰瘍病(Sphaeropsissapinea)、核桃枝枯病(PhomopsisvacciniiShear)、山茶立枯病(Rhizoctoniasolani)的抑制率分別為：29.24%，46.57%，83.39%，66.79%，27.44%(見表3)。其中胡桃醌對馬尾松潰瘍病和核桃枝枯病的抑制效果較好。

表3 胡桃醌對不同植物病菌的抑菌效果初篩Table 3 The inhibitory effect of juglone ondifferent plant pathogen

2.6 胡桃醌對兩種植物病原菌的毒力測定

測定初篩效果較好的2種病原菌馬尾松潰瘍病(Sphaeropsissapinea)和核桃枝枯病(PhomopsisvacciniiShear)的EC50值，結果見表4。

表4 胡桃醌對兩種植物病原菌的毒力測定Table 4 The virulence test of jugloneagainst two plant pathogen

由表4可知，胡桃醌對馬尾松潰瘍病菌的EC50為102.751 mg/L，對核桃枝枯病的EC50為112.808 mg/L。

3 結論

(1)核桃青皮中胡桃醌的最佳提取條件為：超聲100 W 1 h，提取溫度35 ℃，液料比1∶15 g/mL。在此條件下，提取率達到90%以上。超聲法提取青皮中胡桃醌，提取時間短，且操作簡單。

(2)采用HLCP檢測胡桃醌的含量，可以有效地分離出目標與雜質。檢測的胡桃醌回收率在80.66%～109.21%之間，相對標準偏差R2<10%，說明該方法適用于野核桃青皮中胡桃醌含量的檢測。

(3)本地野核桃青皮中胡桃醌含量為0.84 mg/g，高于本地泡核桃和云南泡核桃。

(4)胡桃醌對馬尾松潰瘍病菌和核桃枝枯病菌的抑制效果較好，EC50值分別為102.751 mg/L和112.808 mg/L。表明野核桃青皮具有一定的農藥開發價值。