白頭翁皂苷B4對實驗性急性腎功能損傷的保護作用△

龔琴，王木蘭，何鹿玲，馮育林，楊世林，杜力軍，3，李俊*

1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330006；2.創新藥物與高效節能降耗制藥設備國家重點實驗室，江西 南昌 330006；3.清華大學 生命科學學院，北京 100084

白頭翁Pulsatillachinensis(Bge.)Regel是臨床常用中藥，具有清熱解毒、止痢、燥濕的作用。常用于濕熱痢疾等濕熱證[1]。白頭翁中分離得到多種皂苷類化合物[2-4]，這類化合物具有抗炎、抑瘤等作用[5-13]。白頭翁皂苷B4(簡稱B4)為白頭翁皂苷中主要單體成分之一，屬五環三萜皂苷類化合物，結構母核為23-羥基白樺酸。國內外對于B4的藥理研究報道甚少，僅見少量關于抗肝癌、抗炎作用的體外細胞實驗研究，以及B4在潰瘍性結腸炎大鼠體內藥代動力學相關實驗研究，對于急性腎損傷尚未見有相關報道。我們在前期研究中發現，白頭翁中含量較高的主要成分白頭翁皂苷B4具有較好的抗炎作用，對于體外脂多糖(LPS)所致人胚腎細胞HEK293損傷具有一定的防治作用。為進一步證明B4具有防治腎功能損傷的作用，本團隊利用多種常用方法所致動物急性腎功能損傷模型，從整體動物水平進一步確證B4的相關藥效，同時還進行了小鼠LD50的測定，以期全面反映該藥潛在的研究開發價值。

1 材料

1.1 細胞株

HEK293、人胚腎細胞(中國科學院上海生命科學研究院細胞庫)。

1.2 動物

SD大鼠，體質量160～220 g，雄性，用于甘油所致大鼠急性腎損傷實驗；ICR小鼠，體質量16～18 g，雄性，用于順鉑所致急性腎損傷實驗；Balb/c小鼠，體質量21～23 g，雄性，用于LPS致急性腎損傷實驗；ICR小鼠，體質量18～22 g，雄雌各半，用于急性毒性實驗。上述大小鼠均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2016-0002(小鼠)，許可證號：SCXK(湘)2013-0004(大鼠)。

1.3 藥物與試劑

白頭翁皂苷B4(anemoside B4，C59H96O26，分子量：1221.39，PubChem CID：11636713，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/71307558，分子結構式見圖1。)，由本室植化組提供，純度大于98%(HPLC法)，批號：20161107。

圖1 白頭翁皂苷B4化學結構

地塞米松，0.75g/片，安徽金太陽生化藥業有限公司，批號：15032521。甘油(西隴化工股份有限公司，AR，含量﹥99%，批號：160320，臨用前取甘油加等量的0.9%氯化鈉溶液稀釋成50%甘油溶液備用。順鉑(江蘇豪森藥業集團有限公司，5 mg·mL-1，批號：170503)，臨用前用0.9%氯化鈉溶液配成1.5 mg·mL-1溶液備用。脂多糖(LPS，Sigma公司，Lipopolysaccharides from Escherichia coli O555：B5，L2880-100MG，批號：017M4112V)，臨用前用0.9%氯化鈉溶液配成1.0 mg·mL-1溶液備用。BUN、TP生化試劑盒(日本純藥工業株式會社，批號分別為TR368、DF774)。Cre生化試劑盒(北京利德曼生化股份有限公司，批號：7082216)。Bradford蛋白濃度測定試劑盒(P0006，北京碧云天生物技術公司)。DMEM/HIGH CLUCOSE培養基(Hyclone，LOT No：AC10253739)。澳洲胎牛血清(Hyclone，貨號：SH30084.03)。TRIzol(ambion公司)，LOT：15991210。Realtime PCR Super mix(MF013-01，北京聚合美生物科技有限責任公司，LOT：20170911)。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，基因序列如下：GAPDH，forward，5′-GGTGACTAACCCTGCGCT-3′，reverse，5′-TGACCAGGCGCCCAATAC-3′。TNF-α，forward，5′-AGCACTGAAAGCATCATCCG-3′，reverse，5′-CCGATCACTCCAAAGTGCA-3′。

1.4 儀器

Spectra Max i3型多功能酶標儀(Molecular Devices公司)，7100型全自動生化分析儀(日立公司)，TDZ4型臺式低速離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)，超凈工作臺[日本，SANYO MCV-B161S(T)]，CO2培養箱(日本，SANYO MCO-20ACI)，倒置顯微鏡(日本，OLYMPUS CKX4I)，7500熒光定量PCR儀(AB公司)，5810R冷凍離心機(德國Eppendorf)。

2 方法

2.1 B4抗LPS致HEK293細胞損傷

用DMEM高糖培養基將細胞復蘇、傳代，取對數生長期細胞，經消化后收集細胞接種于96孔板中，細胞密度為4.5×104個/mL，每孔接種100 μL，置37 ℃、5%CO2培養箱培養24 h，棄去細胞上清液加入100 μL終質量濃度10 μg·mL-1的LPS誘導損傷，24 h后加入B4干預，B4終質量濃度為1、10、100 μg·mL-1，同時設置正常組(即不加LPS和B4)及模型組(即加LPS不加B4)。MTT法檢測給藥24 h和48 h細胞的活性(細胞活性=給藥組平均吸光度/正常組平均吸光度×100%)。以上同樣方法LPS誘導細胞損傷，收集B4給藥24、48 h的細胞，按照試劑盒操作說明制備mRNA，并進行qPCR檢測細胞中TNF-α的表達。

2.2 B4抗甘油所致大鼠急性腎功能損傷

取雄性SD大鼠，隨機分為6組，每組10只。正常組、模型組、陽性組(地塞米松0.3 mg·kg-1)、B4高劑量組(2.5 mg·kg-1)、B4中劑量組(1.25 mg·kg-1)、B4低劑量組(0.625 mg·kg-1)。造模前禁水24 h，造成動物脫水，按10 mL·kg-1的體積分別在大鼠兩后肢內側肌肉內注射50%甘油溶液，復制急性腎損傷模型，造模后恢復飲水[14-15]。從造模當天開始連續給藥4 d，正常組、陽性組灌胃給藥(給藥容積10 mL·kg-1)，模型組、B4組尾靜脈注射(給藥容積5 mL·kg-1)。末次給藥后1 h，大鼠異氟烷麻醉后眼球取血，分離血清，采集膀胱尿，檢測總蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)、尿蛋白。

2.3 B4抗順鉑所致小鼠急性腎功能損傷

取雄性ICR小鼠，隨機分為6組。按順鉑15 mg·kg-1的劑量造模，正常組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，其他組腹腔注射順鉑注射液[16]。陽性組地塞米松給藥劑量為0.5 mg·kg-1(灌胃給藥，給藥容積20 mL·kg-1)，B4給藥劑量分別為10 mg·kg-1、5 mg·kg-1、2.5 mg·kg-1(尾靜脈注射，注射容積10 mL·kg-1)，模型組尾靜脈注射等容積的0.9%氯化鈉溶液，正常組灌胃等容積雙蒸水。從造模當天開始連續給藥4 d，末次給藥后1 h眼球取血，分離血清，全自動生化分析儀上檢測總蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)。

2.4 B4抗LPS所致小鼠急性腎功能損傷

取雄性Balb/c小鼠，隨機分為6組，每組15只。LPS靜脈注射造模(劑量10 mg·kg-1)[17]。造模后6 h，各組給予不同劑量的藥物，經過多次預試驗，最終確定B4給藥劑量分別為20、10、5 mg·kg-1(尾靜脈注射，給藥容積10 mL·kg-1)，陽性組地塞米松給藥劑量為0.5 mg·kg-1(灌胃給藥，容積20 mL·kg-1)。模型組腹腔注射等容積0.9%氯化鈉溶液，正常組灌胃等容積的雙蒸水。給藥后6 h(即造模后12 h)眼眶取血，分離血清，檢測總蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)。

2.5 小鼠急性毒性實驗

取ICR小鼠60只，雄雌各半。隨機分為6組，每組10只。對照組、B4的5個劑量組，劑量分別為6、4.8、3.84、3.07、2.46 g·kg-1，每組組間劑量比為1∶0.8。B4各劑量組尾靜脈注射不同劑量的藥物，給藥容積為20～25 mL·kg-1，對照組注射20 mL·kg-1體積的0.9%氯化鈉溶液，給藥1次，觀察2周。給藥后觀察動物體質量變化(每周稱一次)、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物、死亡情況(記錄累積死亡數)及中毒反應(中毒反應的癥狀、嚴重程度、起始時間、持續時間、是否可逆)等。對瀕死及死亡動物及時進行大體解剖，其他動物在觀察期結束后進行大體解剖，觀察動物主要臟器肝、脾臟、胸腺、腎、肺、心臟、小腸、胃等，對異常臟器進行組織病理學檢查。根據死亡數計算死亡率，計算半數致死量(LD50)及95%可信限。

2.6 數據分析

3 結果

3.1 B4對LPS致HEK293細胞損傷的影響

結果顯示，10 μg·mL-1的LPS誘導24 h后細胞活性明顯下降，且炎性因子TNF-α表達顯著上調，B4給藥24、48 h后劑量1 μg·mL-1可明顯增加細胞活性，且10 μg·mL-1及1 μg·mL-1能明顯下調TNF-α mRNA的表達，提示B4對LPS誘導的腎細胞損傷有一定的保護作用(見圖2)。

注：A.B4對LPS致HEK293損傷細胞活性的影響；B.B4給藥24 h對LPS致細胞損傷TNF-α mRNA表達的影響；C.B4給藥48 h對LPS致細胞損傷TNF-α mRNA表達的影響；與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

3.2 B4對甘油所致大鼠腎功能損傷的影響

模型組血清中BUN、Cre及其尿蛋白較正常組明顯升高。B4靜脈給藥后高、中劑量組大鼠血清BUN、Cre明顯下降，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。B4高劑量組大鼠尿蛋白濃度明顯下降(P<0.05)，表明B4對甘油所致大鼠急性腎損傷有一定的保護作用。陽性對照藥地塞米松也在一定程度上保護腎功能，但對尿蛋白無明顯作用，各組大鼠血清總蛋白量差異無統計學意義(見圖3)。

注：A.B4對TP的影響；B.B4對Cre的影響；C.B4對BUN的影響；D.B4對尿蛋白的影響；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05；NS表示差異無統計學意義。

3.3 B4對順鉑所致小鼠腎功能損傷的影響

模型組血清中BUN、Cre較正常組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。B4(10 mg·kg-1)、B4(5 mg·kg-1)組血清BUN、Cre明顯下降，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，提示B4對順鉑所致急性腎損傷有一定的保護作用，能顯著降低急性腎損傷時的BUN、Cre。陽性組血清BUN明顯下降(P<0.05)，對Cre無明顯作用。B4各組小鼠血清總蛋白量無明顯差異。結果見表1。

表1 B4對順鉑所致小鼠急性腎功能損傷的影響

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 B4對LPS所致小鼠腎功能損傷的影響

模型組靜脈注射LPS 12 h后，小鼠血清總蛋白明顯下降，BUN和Cre明顯升高，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.01)。給藥后6 h，B4的3個劑量組血清BUN明顯降低，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，但對Cre則未表現出明顯的作用。陽性藥對血清BUN也表現出明顯的下調作用。結果見表2。

表2 B4對LPS致小鼠急性腎功能損傷的影響

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.5 小鼠急性毒性實驗

靜脈注射不同劑量的B4，各組小鼠表現出不同的反應。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ劑量組動物給藥后自主活動減少，對外反應冷漠，部分動物出現豎毛、消瘦等現象。劑量Ⅰ、Ⅱ組動物死亡時間主要集中在給藥后24～36 h，劑量Ⅲ組死亡時間在給藥后36 h，劑量Ⅳ組動物死亡時間為給藥后72 h內，Ⅴ劑量組無動物死亡。各組小鼠死亡率見表3。采用寇氏式法計算，B4靜脈注射給藥小鼠LD50值為3.36 g·kg-1，95%可信限為3.34～3.37 g·kg-1。

表3 B4靜脈注射給藥所致小鼠死亡率

注：“()”為雄性小鼠死亡數。

4 討論

本研究利用甘油、順鉑和LPS造模，觀察了B4對急性腎功能損傷的保護作用。甘油引起急性腎功能損傷的原理是肌肉注射甘油后，由于禁水及甘油的高滲透壓造成局部體液蓄積而引起血容量降低，腎血流量減少，血液黏度增加，腎血管阻抗增加，血管自身調節功能喪失，導致腎小球濾過率下降。另外，高滲透壓造成肌肉及肌肉血管的溶解，肌紅蛋白、血紅蛋白及鉀的釋放產生腎毒性最終造成腎小球及腎小管損傷[19-21]。順鉑為一臨床常用的非特異性抗腫瘤藥，其細胞毒性對腫瘤進行殺傷的同時，也不可避免地對正常組織細胞產生毒性，因此順鉑在抗腫瘤過程中常導致腎功能損傷已為臨床所常見[22]。腹腔注射順鉑后，可引起腎血管收縮，腎血流量及腎小球濾過率下降，從而引起蛋白尿、腎功能損傷等癥狀[23-24]，對腎臟的不同部位均有毒性，可使腎小球、腎小管功能及形態學改變。LPS誘導的急性腎損傷是其通過激活TLR2/4信號通路，刺激組織細胞炎性壞死因子表達，進而對正常組織細胞產生損傷，其中以腎功能損傷較為明顯[25-27]。我們利用上述3種常規方法對B4防治急性實驗性腎功能損傷的作用進行了觀察，結果表明，B4對這3種模型的急性腎功能損傷均有明顯的保護作用，同時根據體外LPS致人胚腎細胞損傷實驗結果顯示B4對LPS所致炎癥反應有明顯抑制作用，提示該藥在此方面的潛在的藥用價值。

急性腎損傷主要是炎性壞死病理反應，其中最常發生變化的就是TLR4及其下游信號通路，如核因子NFκB及炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6等。近年來，越來越多的研究表明，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)在多種腎臟疾病中發揮著重要的作用，尤其是TLR2和TLR4[28]。綜合文獻關于B4具有抗炎抗癌作用以及抗潰瘍性結腸炎的藥代相關研究報道，可見B4對于炎癥反應具有一定抑制作用。同時本研究在甘油致大鼠的急性腎損傷的實驗中發現，B4可降低腎損傷大鼠尿液中白蛋白量，提示其對腎小球濾過功能有一定的修復作用，對于B4抗腎損傷作用機制研究可從改善腎小球濾過功能，如腎小球基底膜上的足細胞等方面開展。關于B4對急性腎損傷的保護作用機制有待進一步深入研究。

在急性腎功能損傷模型的實驗中，B4對不同原因的模型所用劑量不同。其中對LPS所致急性腎功能損傷的有效劑量在5～20 mg·kg-1。而對順鉑所致急性腎功能損傷的有效劑量在5～10 mg·kg-1，2.5 mg·kg-1劑量未表現出明顯的作用。在甘油所致大鼠急性腎功能損傷模型實驗中，B4的有效劑量在1.25～2.50 mg·kg-1，按照大小鼠體表面積計算，此劑量相當于小鼠的2.5～5.0 mg·kg-1。由此提示對于實驗性急性腎功能損傷模型實驗中，B4的有效劑量在5～20 mg·kg-1，當然最終有效劑量的確定還需要更多實驗的驗證，其中對慢性腎功能損傷的作用有待于進一步研究。

小鼠以B4靜脈給藥，LD50為3.36 g·kg-1，毒性較小。以最大有效劑量20 mg·kg-1計，B4的臨床安全指數(safety index)為168(3.36/0.02)，提示B4在防治急性腎功能損傷方面的安全系數較大。在急性毒性實驗中可見，B4毒性的產生有一個關鍵節點，即劑量在3.84～3.07 mg·kg-1時，劑量為3.84 mg·kg-1時，小鼠死亡率為100%；而劑量降至3.07 mg·kg-1時，小鼠死亡率明顯下降至僅為10%。B4表現出毒性的驟然性變化，其中的機制尚待于進一步研究。

綜上，B4以其毒性較低、治療指數較高等特點，在防治急性腎功能損傷方面具有一定的藥用開發價值，本工作提供了重要的實驗參考。