編碼前蛋白轉化酶枯草溶菌素9基因E670G多態性與中國漢族人群大動脈粥樣硬化性卒中的相關性

陳琳琳, 鄭秋月, 仲啟帆, 陳秋穎,劉筱潔, 于海龍, 陳應柱

(1. 揚州大學臨床醫學院 神經內科, 江蘇省蘇北人民醫院 神經內科, 江蘇 揚州, 225001; 2. 南京鼓樓醫院集團儀征醫院 神經內科, 江蘇 儀征, 215004)

研究[1-4]發現編碼前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(PCSK9)的基因突變可引起遺傳性家族性高膽固醇血癥(ADH)的發生，影響缺血性卒中發生的風險以及氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的生物學特性，從而直接促進動脈粥樣硬化的發展。PCSK9 E670G(rs505151)突變是較為常見的突變類型，許多研究發現PCSK9 E670G多態性與缺血性卒中具有相關性，但是來自不同人群及年齡的研究結果卻存在差異性。本研究檢測動脈粥樣硬化型缺血性卒中患者的PCSK9 E670G基因型以及血液中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平，探討E670G多態性在動脈粥樣硬化型缺血性卒中及其亞型中的發生頻率，以及與動脈粥樣硬化型缺血性卒中及其亞型的相關性，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年9月—2017年4月蘇北人民醫院東院神經內科住院治療的動脈粥樣硬化型缺血性腦卒中患者216例為病例組，年齡27～94歲，均為漢族，彼此無親緣關系。參照疾病國際分類標準第9版(ICD-9)及中國1995年腦血管疾病分類與性卒中。動脈粥樣硬化型腦卒中各亞型診斷依據嚴格的神經學檢查、CT及MRI等影像學檢查。排除標準: 無癥狀性腦卒中患者; 其他類型的缺血性腦卒中患者，包括心源性栓塞型、小動脈閉塞型、其他原因型或不明原因型、短暫性腦缺血發作及出血性腦卒中者; 有心臟病史(風濕性心臟病、心肌病等)和房顫的患者; 創傷或血管夾層引起的血管內皮損傷、嚴重感染、結締組織病、自身免疫病、代謝病(糖尿病除外)和其他嚴重的慢性疾患者(如晚期肝硬化、未經治療的甲狀腺機能亢進或減退等)。選取同期蘇北人民醫院東院神經內科的非腦卒中患者192例為對照組，均為無腦卒中癥狀的健康體檢者，按性別、居住地區、年齡與相應病例匹配，均為漢族，彼此無親緣關系。排除標準同病例組。

1.2 研究方法

收集病例組與對照組的一般信息，如姓名、年齡、性別、高血壓史、糖尿病史、血脂等息。詢問病例組與對照組患者的飲食、吸煙、飲酒等生活習慣及既往病史和家族史。抽取病例組和對照組患者空腹12 h的外周靜脈血5 mL, 儲存在-20 ℃冰箱。血生化指標檢測由醫學檢驗中心完成，包括總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇。

1.3 DNA的提取

以人基因組DNA 樣品為模板，按已優化好的條件進行10 μL體系的PCR反應，其中引物序列為PCSK9 E670G(上游引物): 5′-CACGGTTGTGTCCCAAATGG-3; PCSK9 E670G(下游引物): 3′-GAGAGGGACAAGTCGGAACC-5′。PCR反應體系: 總反應體系為10 μL, 包括基因組DNA模板5 μL, PCSK9 E670G F(20 μmol/L) 1 μL, PCSK9 E670G R(20 μmol/L) 1 μL, dNTP混合液(2.5 mmol/L) 4 μL, Taq聚合酶0.5 μL, 10X PCR Buffer 5 μL, PCR級超純水33.5 μL。反應條件: 95 ℃預變性5 min, 隨后進行35個循環(95 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s, 72℃延伸45 s), 72 ℃再延伸7 min, 4 ℃保存。采用限制性內切酶Ear I進行酶切, 37 ℃溫浴過夜，加酶切產物在1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，紫外燈下觀測電泳結果并拍照。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件包，觀察病例組與對照組的臨床特征，年齡、性別、吸煙、高血壓史和糖尿病史等為計數資料,Pearson卡方(χ2)檢驗比較組間的差異。年齡、甘油三酯、HDL-C、血漿總膽固醇等指標為計量資料，呈正態分布，采用獨立樣本Students′t檢驗比較各組間均數。計算PCSK9基因E670G位點的等位基因頻率與基因型頻率在病例組和對照組的分布，采用卡方檢驗判斷每個多態位點的分布有無地區、性別差異。采用R×C表的Pearson卡方(χ2)檢驗進行E670G的位點關聯分析。不同基因型間LDL-C水平使用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結 果

2.1 病例組與對照組臨床特征比較

病例組與對照組年齡、性別、總膽固醇(TC)比較，差異無統計學意義(P>0.05), 2組在高血壓病史、糖尿病史、既往腦卒中史、吸煙史、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)方面有顯著差異(P<0.05), 見表1。

表1 病例組與對照組一般資料的比較

與對照組比較, *P<0.05

2.2 PCSK9基因E670G PCR產物酶切結果

PCSK9基因E670G PCR產物酶切結果見圖1。

M: DNA 2000 marker; 1～7: samples(1為AA基因型, 2為GG基因型, 3～7為AG基因型)圖1 PCSK9基因E670G PCR產物酶切圖

2.3 PCSK9基因E670G位點多態性基因型和基因位點的分布

病例組基因型AA、AG、GG的例數依次為40例(18.5%)、124例(57.4%)、52例(24.1%)。對照組基因型AA、AG、GG的例數依次為70例(36.5%)、86例(44.8%)、36例(18.8%)。2組基因型頻率分布有顯著差異(P<0.05)。病例組等位基因A、G的例數依次為204例(47.2%)、228例(52.8%), 對照組依次為226例(58.9%)、158例(41.1%), 差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 PCSK9基因E670G位點與動脈粥樣硬化型腦卒中及其亞型關聯性分析

缺血性腦卒中病例組各亞組(動脈-動脈栓塞亞型、穿支動脈口閉塞亞型、低灌注栓子清除功能下降亞型、混合型亞型)的基因型分布無顯著差異(P>0.05)。將4個亞組與對照組比較, a組、b組的等位基因G的基因型頻率顯著增高(P<0.05), GG基因型的頻率也顯著增高(P<0.05); c組、d組的等位基因G、GG基因型頻率與對照組比較無顯著差異(P>0.05), 見表2。

2.5 PCSK9基因E670G多態性與LDL-C的相關性

GG基因型(n=52)的患者LDL-C水平為(3.10±0.66) mmol/L, 高于AG基因型(n=124)的(2.70±0.96) mmol/L與AA基因型(n=40)的(2.66±0.50) mmol/L, 差異有統計學意義(P<0.05), 而AG基因型與AA基因型的LDL-C水平比較無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

研究[6]發現，血清中較高水平的LDL-C與動脈粥樣硬化、冠狀動脈性心臟病(CAD)以及缺血性卒中風險升高相關。在基因因素導致的疾病中，抗利尿激素(ADH)與血液中異常升高的LDL-C濃度以及早期出現的CAD、缺血性卒中相關。編碼PCSK9蛋白的基因是與ADH相關的基因，研究[7]發現PCSK9蛋白是肝細胞表面上低密度脂蛋白受體(LDLR)活性的關鍵調節因素，并且是治療高膽固醇血癥的作用靶點。研究[8-11]表明PCSK9的單核苷酸多態性(SNP)可以顯著影響血液中LDL-C的水平，并發現PCSK9 SNP中E670G(rs505151)基因的多態性與頸動脈內中膜厚度、CAD以及缺血性卒中的風險相關。

本研究發現E670G等位基因在大動脈粥樣硬化(LAA)型缺血性卒中患者中的發生頻率明顯高于非卒中患者，在LAA型缺血性卒中各亞型分析中, E670G等位基因在動脈-動脈的栓塞亞型、

表2 PCSK9基因E670G等位基因與基因型頻率分布[n(%)]

a組: 動脈-動脈栓塞亞型; b組: 穿支動脈口閉塞亞型; c組: 低灌注栓子清除功能下降亞型; d組: 混合型亞型。

與對照組比較, *P<0.05。

穿支動脈口閉塞亞型的卒中患者中的發生頻率與非缺血性卒中患者有顯著差異。提示PCSK9 E670G等位基因是LAA型缺血性卒中的易感性基因, PCSK9 E670G等位基因可以增加LAA型缺血性卒中的風險，且主要發生在動脈-動脈栓塞、穿支動脈口閉塞亞型中。Abboud等[12]研究發現, E670G等位基因與LVA型卒中風險相關，而與SVO型卒中無相關性。Au等[13]在1項Meta分析中也曾報道, OLR1基因中的rs11053646與PCSK9 E670G(rs505151)的多態性與缺血性卒中易感性風險增加相關。Han等[14]研究揭示了PCSK9 rs505151的基因多態性與缺血性卒中風險并無明顯相關性，這可能與選取的缺血性卒中患者類型有關，以上研究均未對缺血性卒中進行TOAST分型，而研究結果也只是在LAA型卒中患者中得到了rs505151基因多態性與卒中風險的相關性，在其他類型的卒中患者中并未得到一致的結果。人群種族來源以及地理環境的差異也可能導致結果的不一致性。

本研究還發現，血液中具有較高LDL-C水平的E670G等位基因攜帶者，其發生LAA型缺血性卒中的風險更高。推測LAA型卒中患者血液中LDL-C水平的升高，可能與LDL-C可以被氧化修飾成ox-LDL, 而ox-LDL能夠誘導血管內皮細胞活化以及功能異常、巨噬細胞及平滑肌細胞的遷移[15-16], 導致局部炎癥反應、氧化應激、壞死以及凋亡的發生[17], 從而促進動脈粥樣硬化的發生、發展密切有關[18-19]。炎癥反應可進一步促進平滑肌細胞分泌PCSK9，而PCSK9不僅在泡沫細胞形成以及動脈粥樣斑塊進展中發揮著重要的作用[20], 其還能促使低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)活化，從而促進平滑肌細胞對ox-LDL攝取，引起炎癥反應的級聯放大，促進動脈粥樣硬化的進展[21]。此外, PCSK9 E670G等位基因突變可使PCSK9與肝細胞表面的LDLR親和力增加，促進LDLR降解，導致血液中LDL-C升高，也可促進動脈粥樣硬化的發展，間接升高LAA型卒中的風險。另外, PCSK9和ox-LDL可通過其他的機制相互作用，促使血管內皮細胞凋亡，可能與動脈粥樣硬化發展有關。

總之，本研究結果表明, PCSK9具有直接以及間接促進動脈粥樣硬化發生、發展的作用。PCSK9 E670G等位基因可能是動脈粥樣硬化型缺血性卒中的新的危險因素，主要在TOAST分型動脈-動脈栓塞、穿支動脈口閉塞亞型中比較明顯，為動脈粥樣硬化型缺血性卒中的風險評估提供了新的方向。