“益氣調血、扶本培元”藥線灸對多發腦梗死性癡呆大鼠海馬ChAT、AChE活性的影響

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(廣西中醫藥大學 針灸推拿學院，廣西 南寧 530001)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由腦血管病引起的以認知功能損害為主要表現的一種中樞神經退行性疾病[1]。流行病學研究表明，VD的患病率非常高，在中國和世界其他國家的老年癡呆癥病例總數中占20%～30%[2]，是癡呆的第二大類型[3]。VD分為多發腦梗死性癡呆(MID)、關鍵部位腦梗死性癡呆和腦低灌流性癡呆[4]。比較常見的是MID，主要是大量微血栓引發的血管性癡呆[5]。隨著卒中后生存率的提高，VD有可能在未來幾十年影響全世界更多的人[6]，但目前尚未發現特別有效的治療靶點[7]。越來越多的證據表明中樞膽堿能系統損傷參與了VD的發病。針灸治療VD是目前公認的療效肯定、副作用極少的療法之一，并且已經取得了一些改善膽堿能系統方面的實驗證據。本實驗重點觀察“益氣調血、扶本培元”藥線灸療法對MID模型海馬中ChAT和AChE兩種酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

ChAT、AChE比色試劑盒96T(南京建成生物工程研究所)；水合氯醛AR250G(No.SHLQ-250)；鹽酸多奈哌齊(國藥準字H20050978，加生理鹽水配成10%濃度的藥液)。Morris水迷宮(中國醫學科學院藥物研究所)，離心機(TGL-16M，湖南湘儀儀器有限公司)，勻漿機(PRO200，FLUKO公司)，紫外可見分光光度計(UV5200PC，上海元析儀器有限公司)，酶標儀(THERMO公司)。

1.2 動物與分組

SPF級SD雄性大鼠100只(廣西醫科大學動物實驗中心)，體重(250±20)g，室溫20～22℃飼養。將100只大鼠隨機分為造模組80只，正常組和假手術組各10只；造模組經Morris水迷宮篩選出40只成功模型，再隨機分為模型組、藥線灸組、西藥組和非穴組，每組各10只。

1.3 造模方法

大鼠預養7天，第8天開始造模。將同種大鼠腹主動脈所取到的血，于37℃溫箱內無菌自然干燥，再將血凝塊研碎，經200μm篩孔過濾備用。應用時取血栓栓子10mg加生理鹽水0.3mL，配制成33mg/mL混懸液。10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3mL/100g體重)。頸部常規備皮，碘伏消毒，頸正中偏右側切開，鈍性分離組織，暴露右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈。用鑷子將頸外動脈挑起，血管下穿兩根縫合線，將遠心端縫合線結扎，近心端縫合線于靠近頸外和頸總動脈連接的地方打成松活結備用。夾閉頸總動脈(留出頸外動脈至頸內動脈的通路)，抓住遠心端縫合線將頸外動脈提起至適合進針的角度，用4.5號針頭于兩根縫合線中間部分進針，從頸外動脈逆行穿刺至頸總動脈與頸內動脈叉口處，適當將松活結拉緊以捆住埋入血管部分的針體(防止血液從進針口溢出)，緩慢注入制備好的栓子鹽水混懸液0.3mL，推注時間不短于30s，使栓子經頸內動脈進入顱內，出針后結扎近心端縫合線，開放頸總動脈夾。切口處滴注青霉素后縫合皮膚，碘伏消毒縫合處。假手術組方法除了頸外動脈穿刺時以生理鹽水0.3mL代替栓子外，其余手術方法與模型組相同。

1.4 模型篩選

造模后第14天(確保手術傷口完全愈合)可對大鼠進行Morris水迷宮隱蔽平臺試驗，每天1次，連續訓練5天。以第5天正常組大鼠逃避潛伏期的均值作為參考值，計算出每個造模大鼠第5天的逃避潛伏期均值與參考值之差占參考值的比值，該值>20%的大鼠則被視為成功模型。

1.5 干預方法

模型篩選后開始各組處理，每天處理1次，每周6次，共4周。具體為：①藥線灸組：遵循“益氣調血、扶本培元”治則[8]取穴，參照中國針灸學會實驗針灸研究會華興邦等制定的《實驗動物穴位圖譜》，選取膻中、中脘、氣海及雙側足三里、血海。采用直徑為0.25mm的3號藥線，點燃線頭變為火珠后用輕刺激手法點灸相應穴位，按“先上后下、先軀干后四肢、先陽后陰”的次序點灸以上腧穴各1壯，順序為膻中、中脘、氣海、足三里、血海。②非穴組：參考于建春等[9]選擇非穴點的方法，取雙側肋下2個固定非穴點作對照刺激點(乳中線旁開2.5mm，肋弓下1mm處)，以相同手法行藥線點灸各1壯。③西藥組：按每天每公斤體重1mg的劑量將配制好的鹽酸多奈哌齊溶液給大鼠灌胃。④正常組、假手術組、模型組均給予相同時間的捉抓刺激。

1.6 取材方法

腹主動脈引出盡可能多的血液后斷頭處死動物，迅速取出整個腦組織，用冰冷生理鹽水洗去殘留血液，在冰上錫紙分離出海馬組織，在電子天平上稱重后迅速置于-80℃冰箱內保存備用待檢測。

1.7 ChAT與AChE活性測定

標本融化后保持在4℃，按照海馬重量與生理鹽水體積比為1/9的比例混合勻漿，離心5min(2500r/min，4℃)，取上清液待測。采用比色法測定ChAT與AchE活性，按相應試劑盒步驟操作。

1.8 統計學方法

采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析。方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett’s T3法。

2 結果

假手術組與正常組比較，ChAT和AChE活性均無統計學意義(P>0.05)。模型組與正常組比較，ChAT活性顯著降低(P<0.01)，AChE活性顯著升高(P<0.01)。藥線灸組、西藥組分別與模型組比較，AChE活性均顯著降低(P<0.01)；藥線灸組與西藥組比較，AChE活性無統計學意義(P>0.05)；藥線灸組、西藥組分別與正常組比較，AChE活性均有統計學意義(P<0.05)。藥線灸組與模型組比較，ChAT活性顯著升高(P<0.01)；藥線灸組與正常組比較，ChAT活性有統計學意義(P<0.05)；而西藥組與模型組比較，ChAT活性無統計學意義(P>0.05)。藥線灸組與西藥組比較，ChAT活性有統計學意義(P<0.01)。非穴組與模型組比較，ChAT和AChE活性均無統計學意義(P>0.05)，說明治療穴具有穴位特異性。詳見表1。

組別ChAT (U/g)AChE (U/mg·prot)正常組228.93±23.370.67±0.14假手術組225.33±23.250.70±0.12模型組124.84±25.40●1.38±0.17●藥線灸組203.73±20.12○■▲◆0.82±0.11○■▲西藥組139.14±19.27●0.79±0.11○■▲非穴組126.04±19.45●1.37±0.14●F / P值51.833 /<0.0160.738 /<0.01

注：與正常組比較，●P<0.01，○P<0.05；與西藥組比較，◆P<0.01；與模型組比較，■P<0.01；與非穴組比較，▲P<0.01。

3 討論

本實驗所采用的微栓子造模法是在梅建勛等[10]的研究基礎上改進，重點是提前結扎頸外動脈遠心端減少遠心斷端出血，并加活結適時捆住頸外動脈近心端埋入的針體，防止推注栓子時由于壓力過大而導致的血液外溢，減少手術創傷和術中視線的干擾，從而進一步提高了造模成功率。

海馬神經元對于缺血特別敏感[11]。慢性腦灌注不足所致血管性癡呆的記憶功能障礙，其原因可能為中樞膽堿能神經元受損，致使腦內學習記憶的神經生化基礎海馬環路損害[12]。乙酰膽堿(Ach)是膽堿能傳導通路中的關鍵神經遞質，其含量與認知功能呈正相關。但Ach性質很不穩定，直接準確測定其水平比較困難。眾所周知，ChAT和AChE是維持腦內Ach含量動態平衡的2種關鍵酶，其測定也更為方便準確。因此，以這2種酶的活性評價VD療效是目前主要的研究方法之一。

多奈哌齊是一種口服藥物，能夠通過血腦屏障可逆地抑制乙酰膽堿酯酶，從而改善認知功能障礙[13]。雖然這種藥物已經在臨床治療VD中應用較多，但其并沒有被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準成為VD的標準用藥。在目前仍然沒有FDA批準的VD治療方案情況下，暫時治療策略主要集中于試圖控制VD引起的認知功能障礙的漸進性[14]。VD的發病機制較為復雜，可能涉及到氧化應激、能量缺乏、血管內皮損傷、炎癥的級聯反應、血腦屏障的破壞、中樞膽堿能通路的損傷等。從目前的VD機制研究中不難看出，中樞膽堿能系統的損傷很可能不是VD發病的上游機制，而是下游機制。雖然以多奈哌齊為代表的膽堿能藥物可以提高中樞膽堿能系統的整體活躍度以改善認知功能，但這種治療方式只是基于癡呆必然出現中樞膽堿能系統障礙的假說(這種假說只在阿爾茨海默病被證實過)，并不一定切中VD的主要病機。另外，該類藥物增加Ach含量還會導致受體的敏感性下降，并伴隨膽堿能副作用，比如暈厥、惡心和嘔吐癥狀的出現[15]。

根據VD的中醫病機特點并綜合各醫家觀點來看，血瘀和痰濁應當是該病的主要致病因素，而多臟腑經絡功能失調則是該病的根本發病機制。“益氣調血、扶本培元”治則最早是基于韓景獻“三焦氣化失常與衰老相關論”[16]提出的。與傳統的培補臟腑陰陽并佐以醒腦開竅的方法區別在于，其強調通過調理三焦氣機來消除因臟腑功能衰退而產生的各種病理產物，并適當調補氣血，促進各臟腑經絡功能的協調，以解除“因衰老而易病，因病而加速衰老”的惡性循環，最大程度地恢復正常衰老之人應有的最佳身體狀態。該治則經過多年的基礎實驗和臨床研究[17]已形成了比較完善的“益氣調血、扶本培元”針法體系。基本取穴為膻中、中脘、氣海、血海、足三里。五穴涉及任脈、足太陰、足陽明三條正經，治則以通為主、以補為輔，重調任脈氣機，佐以生化氣血。任脈貫通腹面，溝通上中下三焦，內聯五臟六腑，為氣血精津液生化和輸布的大通道，是精微物質得以上輸濡養腦髓的關鍵。調理任脈，可使三焦氣機升降的最主要通路得到改善，使中焦脾胃所化生的氣血精微得到最大程度的釋放。除此之外，暢通任脈還能溝通督脈，使一身上下之氣血運行如環無端、生生不惜。足太陰和足陽明兩經居于任脈兩側，以絡脈相連，治之可培補脾胃，增強氣血生化之源，最終達到培補全身臟腑陰陽氣血的目的。為了使操作更加簡便而惠及更多人群，筆者繼承“益氣調血，扶本培元”理念，將其針法改為藥線灸法治療VD并進行了臨床觀察[18]，結果提示藥線灸治療VD在臨床上至少能達到相同穴位的針刺療效，且效果優于西藥多奈哌齊。壯醫藥線點灸療法類似針刺和艾灸的結合體，雖然某些操作在刺激強度上可能比針刺和艾灸要大，但總體比針刺和艾灸操作更加簡便、時短，患者配合度也更高。另外，壯醫藥線點灸療法所使用的藥線是由廣西多種常見中草藥藥液浸泡而成，具有祛風毒、除濕毒、散寒毒、消瘀毒的作用，對于VD發病過程中各種病理產物的清除可能有重要意義。

本實驗研究很好地模擬了MID中樞膽堿能系統損傷里有關酶活性的變化，模型組海馬ChAT活性顯著降低，AChE活性顯著升高。實驗結果表明，“益氣調血、扶本培元”藥線灸療法能顯著提高ChAT活性并降低AChE活性，而西藥多奈哌齊只能降低AChE活性，提示該藥線灸療法在提高大鼠海馬Ach含量以改善中樞膽堿能系統損傷方面整體上可能優于西藥多奈哌齊，療效結果符合此前筆者的臨床研究結論。“益氣調血、扶本培元”藥線灸療法根植于中醫治病的整體觀念，必將對西醫概念中的各種危險因素和發病機制產生影響。而膽堿能系統的改善很可能是上游發病機制陸續改善之后的一種水到渠成的體現。