歸脾湯對化療相關性疲勞模型TNF-α分泌的調節效應

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(遼寧中醫藥大學中醫臟象理論及應用教育部重點實驗室,遼寧 沈陽 110847)

化療是目前治療惡性腫瘤的手段之一，但其化療產生的副作用也逐漸顯現。化療相關性疲勞(Chemotherapy-induced Fatigue，CIF)目前越來越引起人們的重視，它主要表現為化療后出現乏力、失眠、抑郁等多方面擾亂機體正常功能的心理和行為癥狀，嚴重影響著患者的身心健康，甚至還會影響治療效果。化療相關性疲勞的特點是發生快、程度重、持續時間長、不能通過休息緩解。目前對CIF發生的具體機制尚未有明確的闡述，也未發現能夠有效預防或治療CIF的藥物。有關研究表明一些常見的化療藥物(如5-氟尿嘧啶、依托泊苷、多柔比星等)可刺激機體釋放多種炎性因子如TNF-α等，使機體發生一系列生理病理改變[1]。但究竟炎癥因子的分泌是否是化療后產生疲勞的發生機制之一還尚未明了。因此,本研究的目的是通過5-氟尿嘧啶進行造模，初步探究CIF模型中TNF-α的分泌情況，并利用歸脾湯對其進行免疫調節，探討其可能的機制。

歸脾湯始載于宋代嚴用和《濟生方》,主治心脾兩虛之健忘、怔忡。元代危亦林《世醫得效方》增補治療脾不統血而妄行之吐血下血。明代薛立齋《校注婦人良方》在原方中增加了當歸、遠志兩味,一直沿用至今。歸脾湯為中醫經典名方,在臨床各科得到廣泛應用[2]。歸脾湯由人參、白術、黃芪、當歸、甘草、茯神、遠志、酸棗仁、木香、龍眼肉、生姜、大棗組成，其中黃芪、龍眼為君補血養心；人參、白術、當歸為臣補氣健脾；茯神、酸棗仁、遠志、木香為佐寧心安神；炙甘草為使調和諸藥，加姜棗調和脾胃，諸藥合用，具有益氣補血、健脾養心的作用[3]。化療相關性疲勞，從中醫學角度來看，可歸屬于中醫“虛勞”的范疇，我們認為其發生的機制與中醫脾的功能有關，而歸脾湯具有健脾的功能，因此，探究歸脾湯是否能改善化療相關性疲勞及其初步作用機制是我們研究的重點。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級健康C57BL/6小鼠，6周齡，雌雄各半，共80只。(北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK(京)2012-0001，于遼寧中醫藥大學實驗動物中心飼養)

1.2 主要試劑與藥物

5-氟尿嘧啶(5-Fu)(天津金耀氨基酸有限責任公司，20151003)，香菇菌多糖片(江蘇長江藥業有限公司)，歸脾湯(藥用白術30 g、人參15 g、黃芪30 g、當歸15 g、炙甘草8 g、茯神30 g、遠志15 g、酸棗仁30 g、木香15 g、龍眼肉30 g；購于國大藥房，常規煎煮，濃縮為終濃度1 g/mL)[4]，TNF-α檢測試劑盒(武漢優爾生公司，L160607273)。

1.3 主要儀器

大小鼠抓力測定儀(濟南益延科技發展有限公司，型號YLS-13A)，全自動酶標儀(奧地利Anthos公司，17550型)，電熱恒溫培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠，HXP-9052MBE型)，離心機(法國Jouan 公司，C4-12型)。

2 方法

2.1 分組及造模、灌胃方法

2.1.1 實驗分組 將小鼠隨機分成4組，即空白對照組(A組)、化療疲勞組(B組)、香菇多糖組(C組)、歸脾湯組(D組)每組各20只。實驗前正常預養1周。

2.1.2 CIF模型制備及灌胃方法 參考文獻[5]方法，將除A組以外的小鼠腹腔注射5-氟尿嘧啶(5-Fu)，劑量為40 mg/kg，每天給藥1次，連續5天。同時，空白對照組給予生理鹽水腹腔注射。造模前兩天C組給予2 mg/kg香菇多糖0.5 mL/只、D組給予歸脾湯灌胃(0.3 mL/10g·BW)，A組和B組等量生理鹽水灌胃0.5 mL/只，共14天。第15天處死取腹腔巨噬細胞、脾和胸腺。

2.2 觀察歸脾湯對CIF模型疲勞狀況的影響

2.2.1 小鼠體重變化 每6天測一次各組小鼠體重。

2.2.2 抓力測定 先用右手將鼠放在抓力儀上，左手向前推抓力板，然后右手向后滑至鼠尾，左手輕輕松開抓力板，待鼠用力抓住抓力板時，及時加力向后拉，以得到最大抓力。

2.3 觀察歸脾湯對CIF模型TNF-α分泌的影響

2.3.1 腹腔巨噬細胞提取和培養 實驗前三天，向小鼠腹腔內注入6 %無菌淀粉肉湯lmL，以刺激聚集大量的巨噬細胞。頸椎脫臼處死小鼠，將其全部浸入75 %乙醇中浸泡5 min。注射器吸取5 mL PBS液注入小鼠腹腔中，同時用手指從兩側壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內流動。用針頭輕輕挑起腹壁并微微傾向一側，使腹腔中液體集中于針頭下，將腹腔液吸取入針管內。小心拔出針頭，把液體注入離心管。4℃下2 000 rpm離心10 min后，棄上清，加3 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培養液。計數細胞，調整細胞濃度為1×106/mL。每孔加入100 μL細胞懸液，空白對照孔只加100 μL含10 %胎牛血清的RPMI1640培養液。37 ℃，5 %CO2培養箱中孵育2h，倒置顯微鏡下觀察。除去未貼壁細胞，PBS液沖洗1～2次。每孔加入含10 %胎牛血清的RPMI1640培養液，置37 ℃，5 %CO2培養箱中繼續培養24 h后取培養上清液。

2.3.2 炎性細胞因子TNF-α的水平檢測 取腹腔巨噬細胞，按照ELISA試劑盒說明書步驟操作，觀察各組TNF-α的分泌水平。

2.4 統計方法

3 結果

3.1 歸脾湯對CIF小鼠體重的影響

由表1可見，實驗初始時，各組小鼠的體重無明顯差異。實驗第6天時，與A組相比，B、C組小鼠的體重均顯著低于A組(均P<0.01)，而D組小鼠經過歸脾湯的治療，體重明顯高于B組(P<0.01)。實驗第12天時，B組與C組小鼠的體重仍顯著低于A組(均P<0.01)，而D組小鼠體重繼續增長，仍顯著高于B組(P<0.01)，且已與A組無差異(P>0.05)。

組別初始第6天第12天A組23.83±0.7324.40±1.84△△24.21±1.08△△B組23.58±0.7122.01±0.95??21.48±1.37??C組23.23±0.6121.54±1.00??22.20±1.55?D組23.32±1.0823.72±1.15△△24.64±1.20△△

注：**表示與A組相比,P<0.01；△表示與B組相比,P<0.05；△△表示與B組相比,P<0.01。

3.2 歸脾湯對CIF小鼠抓力的影響

由表2可知，實驗初始時，各組小鼠的抓力無明顯差異。實驗第6天時，與A組相比，B組小鼠抓力顯著降低(P<0.05)，C組小鼠抓力比B組高，但無統計學意義，而D組小鼠的抓力明顯高于B組(P<0.01)。實驗第12天時，除A組小鼠的抓力仍繼續增長外，B組基本無變化，而C組和D組小鼠抓力均比第6天時有所下降。

3.3 歸脾湯對CIF小鼠胸腺指數和脾指數的影響

由表3可見，B、C、D組小鼠的胸腺指數均顯著低于A組(均P<0.01)。與B組相比，C組小鼠的胸腺指數略高于B組，但無統計學差異，而D組小鼠的胸腺指數顯著高于B組(P<0.01)。

組別初始第6天第12天A組189.0±24.5225.2±57.6△248.8±57.3△△B組186.5±27.1179.8±41.4?180.0±39.3??C組187.9±36.9213.0±60.9193.0±62.9?D組184.4±18.0241.2±35.9△△230.3±41.1

注：*表示與A組相比,P<0.05；**表示與A組相比,P<0.01；△表示與B組相比,P<0.05；△△表示與B組相比,P<0.01。

組別胸腺指數脾指數A組1.6±0.14△△3.1±0.93B組0.6±0.19?3.0±0.86C組0.8±0.11?3.6±0.33?△△D組1.1±0.14?△△3.8±0.96?△△

注：*表示與A組相比,P<0.01；△表示與B組相比,P<0.05；△△表示與B組相比,P<0.01。

同時，與A組相比，B組的脾指數無明顯變化，但C、D組小鼠的脾指數均顯著高于A組和B組(P<0.01)。

3.4 歸脾湯對CIF小鼠TNF-α分泌的影響

由圖1可知，與A組相比，B組小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α的分泌水平明顯升高(P<0.01)。與B組相比，C組TNF-α的分泌水平降低，但差異無統計學意義(P>0.05)，而D組TNF-α的分泌水平顯著低于B組(P<0.01)。

圖1 歸脾湯對CIF小鼠TNF-α分泌的影響

組別TNF-αA組126.5±28.04△B組219.4±48.68?C組170.9±38.28D組140.3±33.01△

注：*表示與A組相比,P<0.01；△表示與B組相比,P<0.01。

4 討論

實驗初各組小鼠的體重和抓力無顯著性差異，B組與C組小鼠的體重在實驗過程中均先降低后升高，但仍顯著低于A組(P<0.01)。而D組小鼠的體重一直呈上升趨勢，在實驗結束時的體重與A組已無差異(P>0.05)。實驗第6天時，B組抓力顯著降低，抓力的下降說明造模成功。C組小鼠抓力高于B組，但差異無統計學意義(P>0.05)，D組小鼠的抓力較B組明顯升高(P<0.01)。這說明化療在大幅度消耗體重的同時也會損害肌力從而使抓力下降，經過歸脾湯的治療會使體重和抓力均明顯升高，而香菇多糖的治療效果不如歸脾湯。脾主四肢(肌肉)，歸脾湯具有健脾益氣的作用，所以經過治療后抓力會上升，而后可能由于物質消耗或者化療藥物的毒副作用在小鼠體內不斷累積而使小鼠在第12天時的抓力較第6天時有所下降。

與A組相比，B、C、D組小鼠的胸腺指數顯著降低(P<0.01)，這表明化療會損傷胸腺而使胸腺指數明顯降低。C組和D組小鼠的胸腺指數雖低于A組但均高于B組，且D組小鼠的胸腺指數高于C組，這說明經過藥物的治療后會使胸腺指數升高，且歸脾湯療效高于香菇多糖。胸腺是T淋巴細胞發育成熟的場所，而T淋巴細胞可通過細胞免疫機制調節機體的免疫水平，歸脾湯可以使胸腺指數升高，說明歸脾湯對免疫功能具有一定的促進作用[6]。此外，歸脾湯具有益氣養血和健脾的作用，且C組小鼠的脾指數高于A組,這說明歸脾湯對脾臟有一定的免疫調節功能。

TNF-α屬于Th1型細胞因子，主要由單核巨噬細胞產生，具有極強的促炎作用，可誘發并加重炎癥反應，過量的TNF-α會引起免疫系統功能的紊亂從而對機體產生損傷反應[7]。此外，TNF-α在介導機體感染免疫、腫瘤免疫、自身免疫等多方面均發揮著重要的作用[8]。B組小鼠TNF-α的分泌水平明顯升高可能是CIF的發病機制之一，而經過歸脾湯治療后，TNF-α的分泌明顯降低，接近但不能恢復到正常水平，說明歸脾湯有一定的降低TNF-α分泌水平的作用。

化療引起的相關性疲勞，從中醫學角度看，可歸屬于中醫“虛勞”的范疇。虛勞時人體處于臟腑氣血陰陽虧虛的狀態，而中醫認為，“脾胃為氣血生化之源”。脾胃的化源不足、升降失司會引起功能的異常，從而有身重體倦、四肢乏力及免疫力低下的表現。歸脾湯具有顯著的健脾功能，可以通過提高胸腺指數、脾指數并降低TNF-α的分泌水平，提高機體免疫力，從而有效緩解化療引起的相關性疲勞，更深入的機制有待進一步的研究。