全真一氣湯對慢性阻塞性肺疾病大鼠整聯蛋白水平的影響

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(1.福建中醫藥大學，福建 福州 350003；2.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院 呼吸內科，福建 福州 350003)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)作為呼吸系統的常見病之一，若延誤治療，將會演變為慢性肺源性心臟病。肺血管重塑是COPD病情發展中的重要病理過程[1]，且在COPD初期即有肺血管的改變形成，若不及時控制將會使病情進行性惡化。研究表明[2]，COPD組患者肺小動脈存在明顯的肺血管重塑現象，在COPD大鼠實驗中亦見相同結果[3]。整聯蛋白αM(Integrin Alpha M，ITGAM)在COPD患者中高表達[4]，且ITGAM的減少可延緩由慢性缺氧引起的肺動脈高壓的發展[5]。全真一氣湯系明朝醫學家馮兆張著作中的方劑[6]，臨床上使用此方治腎不納氣型COPD患者，頗具療效[7-8]。本實驗在前人研究的基礎上，使用全真一氣湯干預COPD模型大鼠，檢測大鼠右肺組織中ITGAM基因及蛋白水平，探討全真一氣湯對COPD大鼠ITGAM水平的影響，旨在為全真一氣湯治療COPD提供更多實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

18只清潔級SD大鼠采購自廣東省醫學實驗動物中心(合格證號：70092411)的(180～220 g)。本研究醫學實驗于福建中醫藥研究院動物實驗中心鼠類實驗室開展，清潔級。動物使用規范符合《福建省醫學實驗動物管理委員會管理條例》。

1.2 藥物

采用由全真一氣湯生藥制成40%的中藥濃縮湯劑，按0.4 mL/20 g劑量喂養，每日上午8∶00-9∶00灌胃1次。中藥制法：①稱取生藥226 g，于水中浸泡30 min后，再由電爐加熱至沸騰，沸騰后再煎30 min，取濾液；②取濾渣，注水，二次加熱至沸騰后，再煎20 min，再次過濾；③2次濾液混合，加熱濃縮至體積為226 mL，相當于原材料1.0 g/mL。原藥材由福建省藥材公司提供，中藥濃縮湯劑全程由福建中醫藥大學附屬第二人民醫院制劑中心加工完成。

1.3 試劑與儀器

SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒(TaKaRa公司, Code：DRR820A)；RNAiso Plus(TaKaRa公司，Code：D9108A)；ExScriptTM RT Reagent Kit試劑盒(TaKaRa公司, Code：DRR037A)；Rat_Gapdh_primer(TaKaRa公司，Code：D379212)；兔抗大鼠ITGAM抗體(美國Santa Craz公司)；戊二醛(上海化學試劑有限公司)；四氧化鋨(上海化學試劑有限公司)；7500Fast實時熒光定量PCR儀(美國 ABI公司)；Westen-blotting(美國 BIO-RAD)。

2 方法

2.1 動物模型建立、分組及給藥方法

將18只SPF級大鼠隨機分成模型組、中藥組，每組各9只。模型組、中藥組分別于實驗第1天、第11天、第21天使用10 %水合氯醛將大鼠麻醉，手術暴露氣管，經氣管注入內毒素LPS 200 μL(1 mg/mL)。兩組大鼠自第2天起連續煙熏造模，具體為將其放置于30 cm×40 cm×50 cm的有機玻璃熏箱中，箱中煙熏濃度維持于5%左右，煙熏30 min后移至通風處，共60 d(氣管內滴注日不煙熏)。于第2天起，模型組大鼠予以生理鹽水5 mL/d灌服，中藥組大鼠予以全真一氣湯濃縮液(生藥制成40 %的濃縮湯劑，按0.4 mL/20 g/d)灌服，兩組均連續灌服60 d。第60天，于每組隨機取3只大鼠用于取材，取材部位為右肺組織，取材完畢后用消毒錫箔紙將肺組織標本包裹并速凍于液氮中，再轉至-80 ℃冰箱保存，以便用于實時熒光定量PCR及Western Blot檢測。

2.2 觀察指標與測定方法

2.2.1 實時熒光定量PCR檢測 取右肺組織，采用TRIzol(invitrogen)法抽提取總RNA后，用ExScriptTM RT Reagent Kit試劑盒將其逆轉錄為cDNA，再由SYBR Premix Ex Taq II試劑盒以7500 Software v2.0.5進行熒光擴增。使用SYBR Green I嵌合熒光法，引物設計參照 Genebank序列，該序列由自寶生物工程(大連)有限公司合成，基因的上下游引物序列檢測情況見表1。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃延伸1 min，40個循環，GAPDH作為內參照。將模型組mRNA的表達量表示為“1”，再通過校正值計算出中藥組mRNA的相對含量，并比較組間相對量。

2.2.2 Western blot檢測ITGAM蛋白水平 稱量后的組織塊按比例(1∶10)加入對應的裂解液中進行勻漿，離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度。加入buffer，100 ℃變性后，取20 μg電泳，轉膜，于室溫條件下將之浸入于含5 %脫脂奶粉并封閉1 h，加入一抗(ITGAM；CST公司)，4 ℃孵育過夜，次日加入二抗(碧云天，HRP標記)，室溫孵育lh，使用TBST將其充分洗滌后，標本膜上的信號由增強的化學發光系統(ECL)檢測。

表1 檢測基因的引物序列和產物長度

3 結果

3.1 PCR結果

中藥組大鼠ITGAM mRNA表達水平較模型組降低，其表達豐度為模型組的0.630，P值為0.0026(P<0.05)，差異具有統計學意義。見表2、圖1。

表2 模型組與中藥組大鼠ITGAM mRNA表達比較

圖1 模型組與中藥組大鼠ITGAM mRNA表達比較

注：中藥組與模型組比較，P<0.05。

3.2 Western blot檢測

中藥組大鼠ITGAM蛋白表達水平較模型組下調。見圖2。

圖2 各組大鼠ITGAM蛋白表達水平

4 討論

COPD是可預防以及治療的疾病，其發病機制的核心是氣道和肺組織(如肺血管、肺實質)長期持續的炎癥病變，而肺血管存在的持續性炎癥改變與肺血管重塑緊密相關[9]，且與COPD相關的慢性低氧、炎癥以及吸煙會誘導肺血管重塑形成。研究表明[10]，COPD肺血管重塑的特征為血管平滑肌細胞、內皮細胞增殖以及細胞外基質成分增加等。中性粒細胞作為與COPD密切聯系的炎癥因子，其可分泌大量炎性蛋白，促進持續性炎癥，影響內皮細胞，并導致血管壁結構改變和功能發生異常，而ITGAM的下降可顯著降低中性粒細胞與血管內皮細胞的黏附[11]，以延緩肺血管重塑。

ITGAM(Integrin， Alpha M)是構成整合素αMβ2 的一種蛋白質亞基，表達于骨髓細胞如中性粒細胞、單核巨噬細胞等[12]。ITGAM基因位于第16號染色體短臂11 區2帶，約79.08 kb，由30個外顯子、36個內含子構成，其mRNA有12個剪切體[13]，具有調節白細胞活化、黏附和遷移的功能[14]。ITGAM可編碼整合素的α鏈產生CD11b，高水平的CD11b可使中性粒細胞同參與肺血管重塑相關的細胞和細胞外基質的黏附增加[15]，影響血管壁結構和功能異常。CD11b可與結締組織生長因子CTGF結合，參與肺血管重塑[16]。有研究[17]顯示，CD11b參與缺氧所致的肺血管重塑，CD11b在肺動脈高壓組中高表達[18-19]。ITGAM可編碼整合素的β鏈產生CD18，CD18再與CD11b以非共價鍵結合的方式形成結合物CD11b/CD18[20]，CD11b/CDl8參與肺血管重塑[21]。CD11b/CDl8分布于CD8+T細胞[20]，而COPD者的肺血管可見大量CD8+T淋巴細胞浸潤[10]。此外，由ITGAM編碼產生的CD11b/CD18為中性粒細胞上的重要β2整合素受體，同時乃炎癥反應、介導組織損傷的主要受體[20]，且慢性低氧可促進血小板活化因子PAF增加，從而使CD11b/CD18水平上調，使內皮細胞和中性粒細胞的黏附增加[22]，加劇肺血管重塑。

中醫對于COPD常以肺脹等疾病辨證施治，病因有內、外之別，內因主要與肺脾腎三臟功能失調密切相關。COPD屬于慢性疾病，病程長，病性多屬虛，大部分患者有呼多吸少、氣短等腎不納氣癥狀，與中醫久病易致體虛、久病傷腎的特點相符合。全真一氣湯主治腎不納氣型疾病，由熟地黃、人參、白術、五味子、麥冬、牛膝、附子組成[6]，具有同補肺脾腎三臟之功效。現代藥理學研究表明，人參皂苷Rb1可舒張肺動脈，抑制由慢性低氧導致的肺動脈高壓大鼠的肺血管環的收縮效應[23]；懷牛膝具有直接舒張血管內皮細胞的作用[24]，而附子亦可舒張肺動脈[25]，故筆者推測全真一氣湯可能具有延緩肺血管重塑的功效。

本實驗研究結果表明，給予全真一氣湯的COPD大鼠肺組織ITGAM水平較模型組明顯下調，推測全真一氣湯可能通過下調ITGAM水平影響肺血管炎癥病變，從而延緩肺血管重塑過程。