齒瓣石豆蘭化學成分分離與鑒定

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(1.贛南衛生健康職業學院，江西 贛州 341000;2.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004)

石豆蘭屬(Bulbophyllum)是蘭科(Orchidaceae)樹蘭族(Trib.Epidendreae) 石豆蘭亞族(Subtrrib.Bulbophyllinae)下屬之一。該屬植物約1 000余種，主要分布于亞洲、美洲、非洲等熱帶和亞熱帶地區及大洋洲，大多生長在石灰巖上。我國有98種3變種，主產于長江流域及其以南方各省[1]，如云南、廣東、廣西、江蘇、江西、安徽和湖北，其中云南省最多，有12種。廣東省南嶺一帶有廣東石豆蘭、圓葉石豆蘭、齒瓣石豆蘭、密花石豆蘭、芳香石豆蘭、大苞石豆蘭、長足石豆蘭、赤唇石豆蘭[2]。江西齒瓣石豆蘭(Bulbophyllum.levineiSchltr)主要分布于遂川、井岡山等山區。該屬植物是常用中草藥，常作為藥物使用的有廣東石豆蘭、圓葉石豆蘭、齒瓣石豆蘭、密花石豆蘭、芳香石豆蘭、大苞石豆蘭、長足石豆蘭、赤唇石豆蘭，以全草或假鱗莖曬干或新鮮草入藥。該屬植物味甘辛，性涼，可祛風除濕、涼血活血，主治高熱驚風、風濕痹痛、四肢麻木、癰腫、咽痛、跌打損傷[3]，同時還具有養胃生津、祛風除濕、消腫止痛、清熱化痰、舒筋骨、滋陰潤肺等功效[4-5]。有學者從密花石豆蘭全草提取物中發現了具有強烈抑制細胞株作用的成分[6]。本試驗對江西贛州產齒瓣石豆蘭中的黃酮類成分進行研究，為明確其藥理活性物質基礎提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器

XPH-300D數碼型熔點儀(上海比目儀器廠)；Nicolet 5700 型傅里葉變換紅外光譜儀；Inova 500型核磁共振儀(TMS為內標)；Agilent 1100 Series LC/MSD 質譜儀；JASCO P-2000旋光儀；SP-752PC 紫外-可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；制備液相色譜儀為 Shimadzu LC-6AD (制備柱，YMC-Pack ODS-A，20mm×250mm,5μm)；大孔吸附樹脂HP-20(日本三菱公司)；反相硅膠(日本YMC公司)；TE601-L型電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；循環水式真空泵(浙江臨海市精工真空設備廠)；ZF-I三用紫外分析儀(上海寶山顧村儀器廠)；KQ5200E 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；數顯電熱恒溫鼓風干燥箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；RE-3000B上海亞榮旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 藥材與試劑

齒瓣石豆蘭樣品于2017年9月采自江西贛州，性狀特征參照文獻[1]描述，經江中藥業股份有限公司國家二級技師顏干明鑒定為齒瓣石豆蘭。采集到的齒瓣石豆蘭用潔凈的去離子水清洗干凈表面，靜置瀝干多余的水分后放入75℃ 的電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥至恒重。樣品自然冷卻，粉碎，置于干燥器中保存，備用。憑證樣品保存于贛南衛生健康職業學院中藥標本室。試驗用試劑均為色譜純或分析純。

1.3 其他試驗用品

硅膠GF254 薄層板(青島海洋化工有限公司)；柱色譜硅膠G(青島海洋化工有限公司，200～300目)；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(美國 Amersham Pharmacia Biotech 公司)。

2 方法與結果

2.1 提取與分離

取齒瓣石豆蘭全草粉末15 kg，用8倍量水提取3次，每次2 h，合并提取液，用旋轉蒸發儀減壓濃縮，得到濃縮提取物1.4 kg。取提取物1.0 kg，加8倍量95 %乙醇加熱回流提取3次，每次2h，提取液旋轉蒸發儀減壓濃縮，所得流浸膏用水再次攪拌分散，依次用氯仿、甲醇萃取，各萃取液濃縮減壓回收溶劑后得浸膏。制得甲醇萃取部位浸膏330 g棕色物，水溶解后用Diaion HP-20型大孔吸附樹脂吸附，分別用水、15 %乙醇溶液、45 %乙醇溶液及75 %乙醇溶液洗脫進行層析分離，其中75 %乙醇洗脫部位75 g，經正相硅膠柱色譜，氯仿-甲醇系統梯度洗脫，用500 mL收集瓶收集洗脫液，回收溶劑后用薄層色譜法鑒定，合并相似流份(用相同的展開劑在TCL薄層板上呈現斑點及斑點位移相同流份合并)得到9個(Fr.1～9)不同梯度共130個洗脫流份，見表1。

表1 不同梯度氯仿-甲醇洗脫所得的流份

流份Fr.3-9(3.5g)經反復硅膠柱色譜、氯仿-甲醇系統梯度洗脫，目標成分再經結晶分離得到化合物2(18mg)。流份Fr.5-20(5.2g)經反復硅膠柱色譜、氯仿-甲醇系統梯度洗脫得到化合物1(15mg)。流份Fr.3-12(5.1g)經反復硅膠柱色譜、氯仿-丙酮梯度洗脫得到化合物3(9mg)。流份Fr.6-6(8.3g)經Sephadex LH-20柱色譜分離、甲醇洗脫、反復重結晶得到化合物4(8mg)和化合物5(6mg)。

2.2 結構鑒定

化合物的結構鑒定主要依據其理化性質和波譜數據完成。齒瓣石豆蘭主要理化性質包括化合物的性狀、熔點及化學特征反應等。波譜數據主要包括紅外光譜(IR)、紫外光譜(UV)、電子轟擊離子源質譜(EI-MS)、核磁共振氫譜和碳譜的方法(1H-NMR和13C-NMR)。鑒定結果如下。

化合物1：淡黃色針狀，分子式為C17H14O5，mp 138～139 ℃。鹽酸-鎂粉反應呈陽性，顯示為黃酮類化合物。IR (KBr)光譜顯示有羥基在3 510cm-1處有最大吸收，在1728cm-1有羰基吸收峰。苯環吸收：1 637、1 598、1 511、1 453cm-1。EI-MS：m/z 299.1 [M+H]+。1H-NMR(CD3OD,400MHz)δ：3.75(s,3H,-OCH3)，3.8(s,3H,-OCH3)，6.76(d,2H,H-3',-5')，6.81(d,1H,H-8)，6.84(d,1H,H-7)，7.22(d,2H,H-2',-6')，7.25(s,1H,H-5)，14.1(s,1H,-OH)。在較高場中出現的強s峰結合化學位移和碳譜13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)中所顯示的δ55.8 兩峰，說明該分子中有兩個-OCH3，其質子信為δ3.80 (s,6H)。13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ： 55.8(2-OCH3)，116.3(C-3',5')，117.3(C-5)，118.9(C-8),128.4(C-2',6')，121.7(C-7)，125.6(C-4)，137.3(C-2)，150.1(C-9)，155.4(C-6)，159.4(C-4')，161.1(C-1)，179.5(C-3,C=O)。以上理化性質和光譜數據與文獻[6]報道的基本一致，故鑒定化合物1為6-甲氧基-2-(4'-甲氧基苯基)-3-羥基-色原酮。

化合物2：淡黃色針晶，分子式為C15H10O5，mp 167～168℃。鹽酸-鎂粉反應呈陽性，顯示為黃酮類化合物。薄層色譜以5%FeCl3溶液顯色，呈現藍黑色，顯示有酚羥基存在。IR (KBr)光譜在3 295cm-1有羥基的吸收，1 742cm-1處明顯C=O吸收。苯環吸收：1 645、1 581、1 509、1 431cm-1。EI-MS：m/z 270.8 [M ]+，1H-NMR( CD3OD,400MHz) 譜顯示分子中存在1個鄰位取代苯的結構δ4.52 (dd,1H,J=5.6,3.2Hz,H-7)，4.59(dd,1H,J=5.6,3.2Hz,H-6)，1H-NMR(CD3OD,400MHz)δ：4.12 (d,1H,J=1.9Hz,H-4')，4.52 (d,1H，J=8.0Hz，H-7)，4.59(d,1H,H-6)，6.85(d,2H,J=8.3Hz,H-3',5')，6.97(s,1H,H-8),7.46(s,1H,H-5)，7.49(d,2H,H-2',6')，8.41(s,1H,H-1)。13C-NMR(CD3OD,100MHz)δ：103.3(C-8)，108.1(C-5)，115.4(C-5')，118.1(C-3')，119.2(C-4)，124.1(C-2'，6')，126.1(C-1')，130.8(C-2)，146.2(C-6) ，151.1(C-9)，153.2(C-7)，154.3(C-1)，175.3(C-3,C=O)。以上理化性質和光譜數據與文獻[7]報道的基本一致，鑒定化合物2 為6,7-二羥基-3-(4'-羥基)異黃酮。

化合物3：白色粉末狀，分子式為C7H6O2，mp 111～112℃。薄層色譜以5%FeCl3溶液顯色，呈現藍黑色，顯示有酚羥基存在。IR(KBr)光譜顯示有羥基在3 519cm-1處有最大吸收 ，在1 684cm-1處有羰基吸收峰。苯環吸收：1 645、1 591、1 519、1 441cm-1。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)譜芳香區中信號中在低場區給出2組芳氫質子信號：δ7.65 (d,2H，J=8.0Hz,H-2,6)，6.89 (d,2H，J=8.0Hz,H-3,5 )，提示分子中存在一個典型的1,4-二取代苯環，在低場區出現一個醛基信號δ9.82(s,1H,CHO)。EI-MS：m/z 120.9[M]+。1H-NMR(CD3OD,400MHz)δ：9.82(s,1H,CHO)，7.65 (d,2H，J=8.0Hz,H-2,6)，6.89 (d,2H，J=8.0Hz,H-3,5 ),8.92(s,1H,-OH)。13C-NMR(CD3OD,100MHz)δ：116.7 (C-3,5)，129.2 (C-1)，132.1 (C-2,6 )，164.1(C-4 ),192.5(-CHO )。以上理化性質和光譜數據與文獻[8]報道的基本一致，鑒定化合物3為對羥基苯甲醛。

化合物4：無色針狀粉末，分子式為C7H6O3，mp 158～159℃。薄層色譜以5%FeCl3溶液顯色，呈現藍黑色，顯示有酚羥基存在。IR (KBr)光譜顯示有羥基在3 642cm-1處有最大吸收。1H-NMR(CD3OD,400MHz)δ11.19(s,1H,-COOH)顯示有活潑氫。1H-NMR(CD3OD，400 MHz) 譜芳香區中信號中在低場區有4組芳香氫質子信號：δ7.79 (dd,1H，J=8.0Hz,H-6)，7.51(d,1H，J=7.9,7.5Hz,H-4)，7.01(d,1H，J=8.0Hz,H-3)，6.89(d,1H,J=7.9,7.2Hz,H-5)，提示分子中存在苯環的 1,2-二取代。EI-MS：m/z 137.1[M]+。13C-NMR(CD3OD,100MHz)δ：113.5(C-1)，118.2 (C-3)，132.1 (C-6 )，135.9(C-4 )，162.5(C-2)，173.1(-COOH)。以上理化性質和光譜數據與文獻[9]報道的基本一致，鑒定化合物4為鄰羥基苯甲酸(又名水楊酸)。

化合物5：淡黃色粉末，紫外吸收光譜中在波長217、271nm處呈現最大吸收，提示有甲氧基的存在。通過高分辨質譜和質譜測定得到該化合物的相對分子質量為282。1H-NMR譜在低場區給出2組芳香氫質子信號：(CD3OD,360MHz)δ:6.76(d,2H,J=3.0Hz,H-3',5')，7.15(d,2H,J=8.0Hz,H-2',6')，提示分子中存在1個1,4-二取代苯環，δ55.4為甲氧基的信號，氫譜3.79(3H,s)的信號佐證了這一推測。該化合物的HBMC譜(圖1)顯示：5-H(6.96，s)與4-C,9-C相關，8-H(6.31,s)與4-C,6-C,7-C相關，6'-H(7.15,d)與1'-C,2'-C相關，5'-H(6.76，d)與1'-C,3'-C相關，2'-H(7.15,d)與1-C,1'-C,3'-C相關，3'-H(6.76,d)與2'-C,5'-C相關，甲氧基上的氫與4'-C相關。鑒于HBMC譜顯示的相關關系，進一步參照1H-1H COSY和HMQC譜，證實化合物5的結構，結構式如圖2。

圖1 化合物5的HBMC譜 圖2 化合物5的結構式

化合物5的分子式為C16H12O5，mp 257～259℃。鹽酸-鎂粉反應呈陽性，顯示為黃酮類化合物。IR (KBr)光譜顯示，在3121cm-1有羥基的吸收峰，1 749cm-1處明顯C=O吸收。苯環吸收：1 615,1 583,1 521,1 428,1 180,1120,1 011,831cm-1。EI-MS：m/z 284.1[M]+。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:3.79(s,3H,-OCH3)，6.31(s,1H,H-8)，6.76(d,2H,H-3',5')，6.96(s,1H,H-5)，7.15(d,2H,H-2',6')，14.53(s,1H,-OH) 。13C-NMR(CD3OD,100MHz)δ：55.4(C-OCH3)，105.8(C-8)，115.1(C-3',5')，116.9(C-5)，127.6(C-2'，6')，137.1(C-2)，152.1(C-9)，159.6(C-1)，177.3(C-3,C=O)，180.3(C-6)，191.2(C-7)。由以上理化性質和光譜數據，鑒定為未見報道過的新化合物5：7,8-環氧基-2-(4'-甲氧基苯基)黃酮醇，命名為黃酮YN。

3 討論

齒瓣石豆蘭全草具有較高的藥用價值，該屬植物是常用中草藥，全草可入藥。本研究對齒瓣石豆蘭的黃酮類成分進行了分離提取及鑒定，經硅膠柱層析、薄層層析、Sephadex LH-20柱層析和重結晶等方法分離純化，根據化合物的理化性質和光譜數據鑒定其化學結構，從齒瓣石豆蘭的提取物氯仿、甲醇萃取部分共分離到5個單體化合物，分別為6-甲氧基-2-(4'-甲氧基苯基)-3-羥基-色原酮(1)、6,7-二羥基-3-(4'-羥基)異黃酮(2)、對羥基苯甲醛(3)、水楊酸(4)、黃酮YN(5)，所有化合物均為首次從齒瓣石豆蘭全草中分離得到。本研究結果對進一步探索齒瓣石豆蘭的藥理活性物質基礎具有一定的參考價值。