HPLC法同時測定補腎溫肺合劑中6種活性成分含量

，，，，

(湖南中醫藥高等專科學校，湖南 株洲 412012)

補腎溫肺合劑是湖南省直中醫院(我校附屬第一醫院)的院內制劑，由淫羊藿、五味子、山茱萸、防風、白術等十味中藥組成，具有補腎溫肺、固表化飲之功效，臨床上用于過敏性鼻炎、哮喘、慢性支氣管炎等疾病的治療。目前該制劑在質量控制上僅為薄層色譜法的定性鑒別和淫羊藿中淫羊藿苷的含量測定，制劑中其他主要有效成分含量測定的方法尚未見報道。為了更有效地控制該制劑的質量，本文建立了一種同時測定莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲6種主要活性成分含量的方法，為補腎溫肺合劑的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀，包括SPD-M20A二極管陣列檢測器、LC-20AT泵、SIL-20A自動進樣器、島津LC-solution色譜數據工作站；KQ5200DA超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

對照品莫諾苷(批號25406-64-8)、馬錢苷(批號18524-94-2)、升麻素苷(批號80681-45-4)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號84272-85-5)、淫羊藿苷(批號489-32-7)、五味子醇甲(批號7432-28-2)，所有對照品純度均大于98%，均購自貴州迪大生物科技有限責任公司。補腎溫肺合劑(100 mL/瓶，批準文號：湘藥制字Z20070353，批號171010、171206、180320)。甲醇為色譜醇，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對照品溶液 精密稱取莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲的對照品適量，加甲醇溶解并定容于20 mL量瓶中，搖勻，制成含莫諾苷0.33 mg·mL-1、馬錢苷0.26 mg·mL-1、升麻素苷0.39mg·mL-1、5-O-甲基維斯阿米醇苷0.29 mg·mL-1、淫羊藿苷0.25 mg·mL-1、五味子醇甲0.25 mg·mL-1的混合溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液 精密量取補腎溫肺合劑1 mL，置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處理5 min，加50%甲醇至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液，置于陰涼處保存。

2.1.3 陰性樣品溶液 按處方分別制備缺少淫羊藿、五味子、山茱萸、防風的陰性樣品，按照“2.1.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

Phenomenex luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動相：甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，線性梯度洗脫(0～20 min，45%A；20～21 min，45%A→65%A；21～30 min，65%A；30～35min，65%A→67%A)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長240 nm(莫諾苷和馬錢苷)、250 nm(五味子醇甲)、254 nm(升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷)和270 nm(淫羊藿苷)，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。在上述色譜條件下，混合對照品、樣品及陰性樣品色譜圖見圖1。

2.3 線性關系考察

精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分別置于5mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得系列濃度的混合對照品溶液。取上述不同濃度的混合對照品溶液，按照“2.2”項下色譜條件進樣測定。以峰面積為縱坐標，質量濃度(mg·mL-1)為橫坐標，繪制標準曲線，得莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲的回歸方程，見表1。

1.莫諾苷(morroniside)；2.馬錢苷(loganin)；3.升麻素苷(Prim-o-glucosylcimifugin)；4.5-O-甲基維斯阿米醇苷(5-O-methylvisammioside)；5.五味子醇甲(icariin)；6.淫羊藿苷(schisandrin)

圖1混合對照品(A)、樣品(B)、不含山茱萸的陰性樣品(C)、不含防風的陰性樣品(D)和不含淫羊藿的陰性樣品(E)和不含五味子的陰性樣品(F)色譜(254nm)

2.4 精密度試驗

取上述6種組分的混合對照品溶液，連續進樣6次，按照“2.2”項下色譜條件測定，結果莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲的RSD分別為1.2%、1.1%、0.96%、1.3%、0.92%、1.5%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24h進樣測定，結果莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲峰面積的RSD分別為1.1%、0.95%、1.2%、1.5%、0.97%、1.4%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

表1 6個成分的線性回歸方程

2.6 重復性試驗

按照“2.1.2”項下條件平行制備供試品溶液6份，根據“2.2”項下條件進樣測定。結果莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲含量平均值(n=6)分別為2.29、1.13、2.85、0.46、0.32、0.18 mg·mL-1，RSD分別為1.3%、0.95%、0.98%、1.1%、0.99%、1.2%。表明方法重復性良好。

2.7 加樣回收率

精密量取“2.6”項下已測知6種成分準確含量的補腎溫肺合劑樣品0.6 mL，共9份，再分別精密加入相當于含量120%、100%、80%的莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲對照品溶液，分別制備得到高、中、低不同濃度的供試溶液，按照“2.2”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果見表2。

2.8 樣品含量測定

取3個批次的補腎溫肺合劑，按照“2.1.2”項下方法制成供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件測定6種成分含量。結果見表3。

表2 加樣回收率試驗結果 (n=3)

表3 補腎溫肺合劑中6種成分含量 (mg·mL-1，n=3)

3 討論

3.1 質量評價指標的選擇

補腎溫肺合劑中淫羊藿為君藥，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕之功效。淫羊藿中的單體化合物以淫羊藿苷含量最高，現代藥理學研究表明，淫羊藿苷具有抗炎、抗氧化應激、促進神經突觸生長等活性[1]。《中國藥典》(2015版)將淫羊藿苷作為淫羊藿質量控制的指標性成分[2]。五味子也為補腎溫肺合劑中的君藥，具有益氣生津、補腎寧心之功效。五味子醇甲是五味子的主要活性成分，具有抑制腦內神經遞質分泌、保護受損神經細胞等作用[3]。《中國藥典》(2015版)將五味子醇甲作為五味子質量控制的指標性成分[2]。山茱萸和防風均為補腎溫肺合劑中的臣藥。其中，山茱萸具有補益肝腎、收澀固脫之功效，莫諾苷和馬錢苷作為山茱萸的主要活性成分，具有抗氧化應激損傷、抗炎、抗血栓等藥理作用[4]。2015版《中國藥典》將二者作為山茱萸質量控制的指標性成分[2]。防風具有祛風解表、勝濕止痛之功效，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷是防風中含量較高的活性成分，具有止痛、抗炎、解熱等藥理作用[5]。2015版《中國藥典》將二者作為防風質量控制的指標性成分[2]。因此，本文選擇莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲作為補腎溫肺合劑的質量評價指標。

3.2 流動相的選擇

根據相關文獻[6-9]，本實驗首先考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水等不同溶劑系統，結果顯示甲醇-0.1%甲酸水溶液作為洗脫劑可以實現幾種成分的較好分離，且峰形良好。其次，考察了不同的酸(甲酸、磷酸)對分析結果的影響，結果顯示2種酸對分析結果并無明顯影響。在考察酸體積分數(0.02%，0.05%，0.1%，0.2%)時，當甲酸體積分數達到0.1%或0.2%時，色譜峰的峰形良好，但是當甲酸體積分數低于0.1%以下時，5-O-甲基維斯阿米醇苷的峰寬變大。因此，最后流動相條件確定為甲醇-0.1%甲酸水溶液。

3.3 檢測波長的選擇

紫外掃描顯示，莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲的最大吸收波長分別為240 nm、236 nm、254 nm、254 nm、270 nm和251 nm，參照相關文獻[10-13]及《中國藥典》(2015版)一部“山茱萸”“防風”“淫羊藿”“五味子”項下指標成分含量測定波長，確定莫諾苷和馬錢苷的檢測波長為240 nm，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的檢測波長為254 nm，淫羊藿苷檢測波長為270 nm，五味子醇甲的檢測波長為250 nm。