一把毫毛一群小猴

陳冰

重磅新聞！

繼震驚世界的首批體細胞克隆猴“中中”“華華”誕生一年之后，上?？茖W家更進一步，宣布培育出世界首批遺傳背景一致的非人靈長類疾病動物模型——生物節律紊亂體細胞克隆猴模型。

2019 年1 月24 日凌晨，兩篇系列研究論文在線發表于中國頂級綜合英文期刊《國家科學評論》。

1月24日，我國頂級綜合英文期刊《國家科學評論》在線發表了相關系列研究論文。這一科學成果突破了利用活體獼猴體細胞克隆的難關，開啟了標準化創建疾病克隆猴模型的新時代，有助于縮短藥物研發周期，提高藥物研發成功率，將極大地促進生命科學和醫學發展。

在研究神經科學和腦科學的人員只有美國的十分之一，而科研經費只有美國的二十分之一的前提下，我國的體細胞克隆猴技術再次走到世界的最前列。“孫悟空拔一把毫毛變一群小猴的夢想，我們終于實現了！”中國科學院神經科學研究所所長蒲慕明院士表示，這次的克隆猴來自青年基因編輯猴的成熟體細胞，這使我國在建立非人靈長類動物模型的國際競爭中的領先優勢進一步擴大。

生物節奏紊亂引發眾多疾病

雄雞報曉，蜘蛛半夜結網，向日葵在清晨開放……自然界所有生物的生命活動都存在節律現象，與地球24小時的自轉周期保持同步對于生物維持健康的生理狀態至關重要。經過長時間的研究，人們發現，其實生物的節律與基因密切相關，2017年的諾貝爾生理或醫學獎就被獎勵給了三位研究節律相關基因的科學家。

特別是現代社會，巨大的工作生活壓力使人類的作息時間很難嚴格遵循于體內的生物鐘。加班、輪班，頻繁地跨越時區，熬夜玩手機等等，越來越多的人面臨著生物鐘紊亂的困擾，晝夜節律紊亂與睡眠障礙、神經退行性疾?。ㄈ绨柎暮ＤY）、精神疾?。ㄈ缫钟舭Y）、糖尿病、腫瘤，以及心血管疾病等密切相關。

然而，由于小鼠、果蠅等傳統動物模型與人的晝夜活動周期、腦結構和代謝速率等存在顯著差異，極大制約了生物節律紊亂相關疾病機理和診治手段的研發。神經科學研究所非人靈長類研究平臺主任孫強指出，非人靈長類實驗動物曾在人類攻克傳染病等各種疾病中發揮重要的作用。并且非人靈長類動物與人類最接近，是研究節律紊亂相關疾病機理和診治手段比較理想的動物模型，因此建立非人靈長類生物節律紊亂模型迫在眉睫。

通過研究，科學家們發現在哺乳動物的大腦中有一個控制生物節律的“起搏器”，這個“起搏器”是通過一系列節律基因調控晝夜節律，這些核心節律基因之一便是BMAL1。在此背景下，中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）、上海腦科學與類腦研究中心研究團隊經過兩年多的努力，首次利用CRISPR/Cas9方法，敲除了體外受精的猴胚胎中的生物節律核心基因BMAL1，產生了一批BMAL1缺失的獼猴，2016年中旬，五只BMAL1基因敲除的獼猴順利誕生。

那么這些猴子有沒有表現出周期紊亂的癥狀呢？

為此等到半年后小猴斷奶，研究人員就從多個方面開始觀察敲除猴的生物節律。研究人員給猴子們佩戴了“運動手環”，可以隨時監測到它們的晝夜活動情況，發現敲除猴并未按照24小時的周期活動，在夜間活動明顯增多，這說明敲除猴可能出現了失眠的問題。于是研究人員通過手術，在猴子背部皮下埋入記錄腦電和肌電的植入子，分析其睡眠周期發現敲除猴的快速眼動睡眠（REM，淺睡期）和慢波睡眠（NREM，熟睡期）明顯減少。

在另一方面，研究人員通過搜集連續兩天多個時間點的血液樣本，對那些受節律調節的神經內分泌激素水平進行測定，發現幫助進入睡眠的褪黑素在敲除猴中分泌較少。同時研究人員還進行了基因表達譜分析，發現敲除猴的大多數節律基因表達異常，還有很多與睡眠剝奪，抑郁癥以及衰老等相關的基因上調。

節律紊亂往往伴隨著神經退行性疾病的發生，神經退行性疾病患者往往會遭受各種各樣的睡眠問題，包括失眠、睡眠中斷、日間過度嗜睡，繼而出現睡夢中運動，白天與人交流出現障礙等等。但在之前，人們一直不太清楚這些究竟是睡眠紊亂的直接后果，還是長期失眠或服藥的副作用。

從對這五只基因敲除猴的研究可以看到，猴子表現出怕人，避免與人對視等問題，而這些癥狀是以前在小鼠身上很難探測到的。

此外，有很多研究表明節律紊亂或睡眠障礙還是一些精神疾病，如雙相情感障礙，抑郁癥等癥狀。但是之前我們很難認定一只小鼠有抑郁或是雙相情感障礙之類的問題，而這在靈長類身上就很明顯了。研究人員在血液檢測中發現與壓力應激相關的皮質醇在敲除猴的血液中一直處于高水平，這讓他們聯想到敲除猴在與人接觸時極度緊張的反應。當有人靠近敲除猴時，它會雙手抱住頭部，蜷縮在角落里，不敢活動。如果將敲除猴放入一個新環境中，它也不能很快地適應，不敢像正常猴那樣在環境中自由探索。

研究人員還給猴子們做了一個經典的聽覺刺激實驗，在給出的一連串規律的聲音中隨機插入特殊的聲音，記錄猴子聽到聲音時的腦電，發現敲除猴大腦在識別和反應這些特殊事件的能力上不如正常猴，這與精神分裂患者的情況類似。

中科院神經所研究員張洪鈞說，基因敲除后，出生不到一年的A6猴的睡眠就出現了接近衰老的現象，已與人類老年期類似。一年后又出現了焦慮、抑郁、精神分裂等嚴重癥狀，同時通過血液檢測發現了激素水平異常。也就是說，有了遺傳背景一致的疾病模型猴，就能研究相關發病生理指標，還可進行藥物干預，這將大大推進相關疾病的研究。

張洪鈞告訴記者，之所以如此大費周章構建基因敲除猴，最期望的就是在這些猴身上找到節律紊亂者的精神癥狀，這些才是非人靈長類較之小鼠等實驗動物的真正優勢。“BMAL1敲除小鼠的睡眠相比正常對照則是增多的，這也進一步說明了非人靈長類在腦疾病研究上的巨大優勢?；蚯贸餅槟M人的節律紊亂相關疾病邁出了關鍵的第一步。

基因編輯克隆猴也得了精神病

通過敲除BMAL1基因獲得的第一代模型猴還不算完美的動物模型，因為這些基因敲除猴屬于“嵌合體”，體內不同細胞的基因型有差別，所表現出的癥狀嚴重程度不一致，不能作為理想的動物模型。那么，能否利用“中中”“華華”這樣的克隆猴技術，構建出疾病模型猴呢？

“可以說是馬不停蹄，我們很快投入到了新的任務中，在國際上首次獲得了5只遺傳背景一致的生物節律紊亂克隆猴。”中科院神經所孫強研究員介紹，最大的一只出生于2018年7月12日，已脫離人工哺乳，一緊張就會抱頭，見了保育員就心跳加速，白天晚上無規律地睡眠——在神經所非人靈長類研究中心的孵育箱里，這只編號B1的食蟹猴斷奶之后表現出了與本體基因編輯猴A6明顯相同的生物節律紊亂癥狀。

接下來將研制系列疾病模型猴，包括抑郁癥、帕金森癥和阿爾茨海默癥等腦疾病，這些腦疾病模型克隆猴，未來將有助于解析腦重大疾病的致病機理、確立預警和早期診斷指標、進行干預和治療等。

孫強研究員指出，國際上通行的驗證克隆動物的金標準是比對細胞核和線粒體基因。檢測表明，這5只基因編輯克隆猴的細胞核基因型與核供體細胞完全一致，而線粒體基因型則與卵供體猴一模一樣，同時它們的任何基因與生出它們的代孕媽媽徹底無關，非常符合克隆動物的鑒定金標準。

中科院神經所劉真研究員介紹，此次克隆有兩個技術突破。第一，不同于“中中”“華華”從流產母猴的胚胎體細胞克隆而來，這次選擇了1只一歲半、睡眠紊亂最明顯的公猴來提供體細胞，被國際同行評價為“首次證實通過體細胞核移植技術可以克隆成年基因修飾猴”。盡管克隆技術路線是一致的，但在效率上略高于“中中”“華華”，這將在很大程度上打消人們對于克隆技術效率的擔憂。第二，首次利用基因編輯猴的體細胞得到克隆后代。“中中”“華華”都是野生型猴，從疾病研究的角度來說，不如基因編輯猴的克隆后代，這也回答了“攜帶有特定基因編輯的體細胞是否可以用來克隆”的疑問。

“中中”、“華華”與此次研究所用的克隆猴流程示意圖。科學家會先去除猴卵細胞的細胞核，然后在其中放入另一只猴的體細胞核，等待兩者充分融合后，最后將這個核移植過的卵移植到代孕母猴體內等待克隆猴出生。

可以說，本次研究意味著克隆基因編輯猴技術由此從理論層面邁向了實踐層面，鑒于目前克隆技術是制造基因編輯猴的成本最低、耗時最少的手段，而作為全球暫時唯一掌握克隆猴技術的神經所，有望在未來的神經科學研究中搶先一步。

藥物研發周期縮短

“腦疾病的社會負擔越來越大，平均每個腦疾病藥物需耗費數十億美元和10年以上時間，失敗率大于90%。有了疾病猴模型，有望縮短藥物研發周期，降低研發成本。”中科院神經所所長蒲慕明院士說。

人類很多與神經系統相關的疾病，如阿爾茨海默癥、自閉癥、心腦血管疾病等，很難通過小鼠來模擬?！皼]有猴子作為實驗動物模型，神經科學很難有實質性推進?！逼涯矫髡f，這就是神經所畢十年之功，全力攻克克隆猴及疾病模型猴這一難關的原因。

一個藥物在臨床前，需要在動物身上檢驗安全性、代謝情況和藥效評估。通過近親繁殖20代產生的小鼠，雖然沒有遺傳背景干擾，但由于和人的差異太大，許多神經類、精神類藥物，即使90%在小鼠身上有效果，但到了臨床還是無效或有副作用。國際上許多知名藥企，每年用約10萬只獼猴來做藥物安全性和代謝檢測，但由于沒有合適的非人靈長類疾病模型，很難開展藥效檢測。“獼猴5到6年才能有一代，無法通過近親繁殖手段得到遺傳背景一致的實驗猴，最好的辦法就是克隆?！?/p>

“現在只是一個起點?！逼涯矫鹘榻B，接下來將研制系列疾病模型猴，包括抑郁癥、帕金森癥和阿爾茨海默癥等腦疾病，以及免疫缺陷、代謝紊亂、腫瘤等疾病。這些腦疾病模型克隆猴，未來將有助于解析腦重大疾病的致病機理、確立預警和早期診斷指標、進行干預和治療等?！耙荒昵?，我認為國際同行追趕上我們的時間是一年，但這次論文發表后，我們在國際上的領先優勢進一步擴大?！逼涯矫魍嘎?，目前美國、澳大利亞、以色列和歐洲一些國家都有科學家團隊向神經所提出合作意向，很快將有多支國際科研團隊全職入駐松江區，利用包括疾病克隆猴在內的非人靈長類模型開展前沿研究，這將為上海集聚起一批國際頂尖科學家?！敖⒒诩膊∧Ｐ秃锏姆侨遂`長類平臺，將成為中國腦計劃的一大亮點。”

1月23日，中科院神經所和中科院上海藥物所簽訂了戰略合作框架協議，后者有20多種藥物將進入臨床，雙方將共建非人靈長類藥物篩選模型。目前，已有多家制藥企業對疾病克隆猴表示了濃厚興趣。未來，G60腦智科創基地將建立相關產業平臺。