銅綠假單胞菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法在實(shí)驗(yàn)小鼠微生物控制中的應(yīng)用

向欽， 王會(huì)娟， ， 劉陽(yáng)， 伍悅， 曹敏， 賴(lài)國(guó)旗， 何明忠*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，重慶400016； 2. 浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，杭州310058；3. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科，重慶400010)

銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa通常被稱(chēng)為綠膿桿菌(Silbyetal.，2011)，為臨床上較常見(jiàn)的人獸共患致病菌，在人體的各個(gè)部位都可能存在，一般出現(xiàn)在動(dòng)物的鼻咽部和下消化道。銅綠假單胞菌感染后滲出液等呈綠色，能夠引起化膿性病變，嚴(yán)重影響人和動(dòng)物的健康以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(Gordonetal.，1955；蔣觀成，浦野徹，1991；Baker，1998)。快速、準(zhǔn)確地檢出銅綠假單胞菌，對(duì)控制該病原菌的感染具有重要意義。目前，銅綠假單胞菌的檢測(cè)方法主要有細(xì)菌分離鑒定、免疫學(xué)、PCR等。其中，細(xì)菌分離鑒定法準(zhǔn)確性高，但耗時(shí)費(fèi)力、檢出率低、易漏檢；免疫學(xué)法檢測(cè)過(guò)程繁雜、周期長(zhǎng)、靈敏度低(王燕等，2010)；盡管PCR法靈敏度較高，但對(duì)儀器設(shè)備要求嚴(yán)，很難在基層單位推廣應(yīng)用(Lodengetal.，2006；Deschaghtetal.，2009；Schwartzetal.，2010)。因此，探索準(zhǔn)確、高效的銅綠假單胞菌檢測(cè)方法，對(duì)人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染的預(yù)防和控制都極其重要。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)(Notomietal.，2000；Yoneyamaetal.，2007)具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀、特異性強(qiáng)及比普通PCR靈敏度高等突出優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于一些病原微生物的檢測(cè)(Iwamotoetal.，2003；Horisakaetal.，2004；Songetal.，2005)，包括銅綠假單胞菌(Gotoetal.，2010；Diribeetal.，2015；Kimetal.，2016)。由于LAMP的引物是擴(kuò)增技術(shù)的關(guān)鍵所在，不同區(qū)域的引物對(duì)目的基因的擴(kuò)增效果有重要影響。根據(jù)LAMP的基本原理，針對(duì)銅綠假單胞菌oprL基因序列的新區(qū)域，設(shè)計(jì)了相應(yīng)的LAMP特異性引物，通過(guò)優(yōu)化，達(dá)到高效、特異、靈敏的結(jié)果，并以《GB/T 14926.17-2001 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 綠膿桿菌檢測(cè)方法》和PCR法為對(duì)照，通過(guò)實(shí)驗(yàn)小鼠血清樣本對(duì)建立方法進(jìn)行驗(yàn)證，以期為豐富銅綠假單胞菌的檢測(cè)手段提供重要依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備

銅綠假單胞菌(菌株編號(hào)：ATCC27853)由重慶市疾病預(yù)防控制中心饋贈(zèng)；甲型副傷寒沙門(mén)桿菌SalmonellaparatyphoidA(菌株編號(hào)：CMCC50093)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌Salmonellatyphimurium(菌株編號(hào)：CMCC50115)、肺炎克雷伯桿菌Klebsiellapneumoniae(菌株編號(hào)：CMCC46117)、嗜肺巴斯德桿菌Pasteurellapneumotropica(菌株編號(hào)：ATCC35149)、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(菌株編號(hào)：ATCC-25923、CMC6003)均由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所饋贈(zèng)；87只實(shí)驗(yàn)小鼠(24只C57BL/6J小鼠、24只KM小鼠、16只BALB/c小鼠、23只各品系轉(zhuǎn)基因小鼠)及其血清樣本隨機(jī)抽取于重慶市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(渝)2012-0001、-0003、-0005、-0006；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(渝)2012-0001]。

1.2 試劑及儀器

Bst酶3.0購(gòu)自New England Biolabs；Taq DNA聚合酶、dNTPs、基因組DNA提取試劑盒(DP304)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；NAC(naldixic acid cetrimide)液體/固體培養(yǎng)基購(gòu)自北京三藥科技開(kāi)發(fā)有限公司；腸桿菌科細(xì)菌編碼(杭州)購(gòu)自杭州微生物試劑廠；低溫離心機(jī)、紫外可見(jiàn)核酸蛋白分析儀Bio Mate 3S購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；LAMP實(shí)時(shí)濁度儀(LA-320)和擴(kuò)增試劑盒(4X004)購(gòu)自日本榮研化學(xué)株式會(huì)社；SYBR Green Ⅰ購(gòu)自InvitrogenTMThermo Fisher Scientific；PowerPac3000電泳儀、GelDocXR+凝膠成像分析儀及PCR熱循環(huán)儀(S1000TMThermal Cyclers)購(gòu)自Bio-Rad(上海)有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器購(gòu)自上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司。

2 方法

2.1 DNA模板準(zhǔn)備

NAC固體培養(yǎng)基上接種銅綠假單胞菌菌株，37 ℃培育20 h左右，挑單菌落在相同條件下用NAC液體培養(yǎng)基進(jìn)行培育。菌液DNA提取步驟為：取菌液12 000 r·min-1離心5 min，加10 mmol·L-1Tris-EDTA(pH7.5)緩沖液50L，100 ℃ 10 min，-20 ℃ 2 min，12 000 r·min-1離心10 min，分離上清，-20 ℃儲(chǔ)存。

2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)銅綠假單胞菌oprL基因序列，在新區(qū)域內(nèi)用PrimerExploer V4分別設(shè)計(jì)包含內(nèi)引物(FIP、BIP)、外引物(F3、B3c)和環(huán)引物(LFc、LB)在內(nèi)的3對(duì)LAMP特異性引物；根據(jù)參考文獻(xiàn)(de Vosetal.，1997；邢進(jìn)等，2012)合成2套PCR引物[oprL(F1、R1)，16SrRNA(F2、R2)](圖1，表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

圖1 環(huán)介異等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)引物在oprL基因的位置(GenBank登錄號(hào)： Z50191.1)Fig. 1 The position of loop-mediated isothermal amplification primers in oprL gene (GenBank accession number： Z50191.1)

注： B3c、F1c、B2c、LFc分別為B3、F1、B2、LF的互補(bǔ)序列

Note： B3c, F1c, B2c and LFc are complementary sequence of B3, F1, B2 and LF, respectively

2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化

2.3.1溫度優(yōu)化根據(jù)Bst酶最佳溫度范圍：60～66 ℃，設(shè)置8個(gè)溫度梯度進(jìn)行反應(yīng)：59 ℃、60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃、66 ℃。最佳反應(yīng)溫度判斷標(biāo)準(zhǔn)為：LAMP開(kāi)始擴(kuò)增的時(shí)間較早、最大擴(kuò)增效率高且用時(shí)較短。

2.3.2內(nèi)引物濃度優(yōu)化設(shè)置8個(gè)濃度梯度的內(nèi)引物(FIP/BIP)：20 μmol·L-1、30 μmol·L-1、40 μmol·L-1、50 μmol·L-1、60 μmol·L-1、70 μmol·L-1、80 μmol·L-1、90 μmol·L-1(即以40 μmol·L-10.5 μL FIP和40 μmol·L-10.5 μL BIP為起點(diǎn)，按0.25 μL梯度等差遞增體積等量加至2.25 μL)，再分別加入5 μmol·L-1F3/B3c、20 μmol·L-1LFc/LB和Bst酶各1 μL，模板DNA 1 μL，2×RM緩沖液12.5 μL，無(wú)酶水補(bǔ)齊25 μL，混勻，在最佳反應(yīng)溫度下反應(yīng)。最佳的內(nèi)引物濃度判斷標(biāo)準(zhǔn)為：擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間較早、最大擴(kuò)增效率較大且用時(shí)較短。

2.3.3環(huán)引物濃度優(yōu)化設(shè)置6個(gè)濃度梯度的環(huán)引物(LFc/LB)：10 μmol·L-1、15 μmol·L-1、20 μmol·L-1、25 μmol·L-1、30 μmol·L-1、35 μmol·L-1(即以20 μmol·L-10.5 μL LFc和20 μmol·L-10.5 μL LB為起點(diǎn)，按0.25 μL梯度等差遞增體積等量加至1.75 μL)，再分別加入70 μmol·L-1FIP/BIP、5 μmol·L-1F3/B3c、Bst酶各1 μL，2×RM緩沖液11.5 μL，模板DNA 1 μL，無(wú)酶水補(bǔ)齊25 μL，混勻，在最佳反應(yīng)溫度下反應(yīng)。最佳的環(huán)引物濃度判斷標(biāo)準(zhǔn)為：擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間較早、最大擴(kuò)增效率較大且用時(shí)較短。

2.4 特異性試驗(yàn)

按照上述新建立的LAMP體系，檢測(cè)其對(duì)包括銅綠假單胞菌在內(nèi)的7株菌株(ATCC27853、CMCC50115、CMCC50093、ATCC35149、CMCC46117、ATCC25923、CMC6003)的鑒別能力，樣本擴(kuò)增后加入1 μL SYBR Green Ⅰ后，使用LAMP實(shí)時(shí)濁度儀觀察顏色變化，產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取6份不同批次銅綠假單胞菌菌液提取DNA，用新建立的LAMP體系進(jìn)行檢測(cè)。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取6份同批次銅綠假單胞菌菌液提取的DNA，用新建立的LAMP體系進(jìn)行檢測(cè)。

2.7 靈敏度試驗(yàn)

紫外可見(jiàn)核酸蛋白分析儀測(cè)定菌液DNA濃度，取已知濃度的銅綠假單胞菌DNA，將銅綠假單胞菌DNA起始濃度設(shè)為2.9 μg·mL-1，按10倍濃度梯度進(jìn)行稀釋至10-8或10-9，分別用已建立的LAMP方法及文獻(xiàn)報(bào)道的PCR方法(de Vosetal.，1997；邢進(jìn)等，2012)進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)定二者對(duì)銅綠假單胞菌的檢測(cè)限。

2.8 臨床樣本的檢測(cè)

隨機(jī)抽取重慶市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)中心87只小鼠，每只小鼠同時(shí)收集血清及回盲部?jī)?nèi)容物，利用DNA試劑盒提取血清DNA樣本，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，隨后每個(gè)樣本中加入1 μL SYBR Green Ⅰ觀察顏色變化；同時(shí)，按照《GB/T 14926.17-2001 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 綠膿桿菌檢測(cè)方法》檢測(cè)，即采取回盲部?jī)?nèi)容物接種NAC液體培養(yǎng)基，置于(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察生長(zhǎng)情況，對(duì)未產(chǎn)生綠色色素者轉(zhuǎn)種NAC瓊脂平皿，(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h，對(duì)生長(zhǎng)特性及菌落特征與銅綠假單胞菌一致的菌落進(jìn)一步進(jìn)行生化鑒定；LAMP或《GB/T 14926.17-2001 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 綠膿桿菌檢測(cè)方法》檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣本，進(jìn)一步用PCR方法驗(yàn)證。

3 結(jié)果

3.1 反應(yīng)體系的建立

3.1.1溫度優(yōu)化比較8個(gè)溫度梯度擴(kuò)增結(jié)果，滿(mǎn)足擴(kuò)增效率最大且用時(shí)最短的溫度為66 ℃，即確定66 ℃為最佳反應(yīng)溫度(圖2)。

圖2 溫度優(yōu)化Fig. 2 Optimization of temperature

3.1.2內(nèi)引物濃度優(yōu)化在內(nèi)引物濃度為70 μmol·L-1時(shí)，反應(yīng)體系在15 min左右開(kāi)始擴(kuò)增，此時(shí)的最大擴(kuò)增效率較高，并且達(dá)到最大擴(kuò)增效率用時(shí)相對(duì)較短，因此將70 μmol·L-1判定為反應(yīng)的最佳內(nèi)引物濃度(圖3)。

3.1.3環(huán)引物濃度優(yōu)化在環(huán)引物濃度為30 μmol·L-1時(shí)，反應(yīng)體系在12 min左右開(kāi)始擴(kuò)增，此時(shí)的最大擴(kuò)增效率較高，并且達(dá)到最大擴(kuò)增效率用時(shí)較短，故將30 μmol·L-1判定為反應(yīng)的最佳環(huán)引物濃度(圖4)。

圖3 內(nèi)引物濃度優(yōu)化Fig. 3 Optimization of inner primers concentration

A.不同內(nèi)引物濃度下環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增效率， CH1～CH8為20～90 μmol·L-1的8個(gè)內(nèi)引物濃度梯度； B. 不同濃度內(nèi)引物下的擴(kuò)增時(shí)間和最大擴(kuò)增效率

A.amplification efficiency of loop-mediated isothermal amplification under different concentrations of inner primers， CH1-CH8 indicate different concentration gradients of inner primers from 20 μmol·L-1to 90 μmol·L-1； B. amplification time and maximum amplification rate under different concentrations of inner primers

3.1.4最終反應(yīng)體系的建立通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件最終確定：66 ℃為最佳反應(yīng)溫度，反應(yīng)體系(25 μL)如下：2×RM緩沖液12.5 μL，70 μmol·L-1FIP、70 μmol·L-1BIP、5 μmol·L-1F3、5 μmol·L-1B3c、30 μmol·L-1LFc、30 μmol·L-1LB、Bst酶和模板DNA各1 μL，無(wú)酶水4.5 μL。

3.2 特異性

結(jié)果僅顯示銅綠假單胞菌的DNA樣本為陽(yáng)性(圖5：A)；其余6株菌株(鼠傷寒沙門(mén)氏菌、甲型副傷寒沙門(mén)桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、肺炎克雷伯桿菌、2株金黃色葡萄球菌)的DNA樣本均為陰性。向擴(kuò)增后的產(chǎn)物中加1 μL SYBR Green Ⅰ觀察顏色，發(fā)現(xiàn)只有銅綠假單胞菌的DNA樣本能看到翠綠色(圖5：B)；瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可知僅銅綠假單胞菌DNA樣本擴(kuò)增出清晰的條帶(圖5：C)。

圖4 環(huán)引物濃度優(yōu)化Fig. 4 Optimization of loop primers concentration

A.不同環(huán)引物濃度下環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增效率， CH1～CH6為10～35 μmol·L-1的6個(gè)環(huán)引物濃度梯度； B. 不同濃度環(huán)引物下的擴(kuò)增時(shí)間和最大擴(kuò)增效率

A.amplification efficiency of loop-mediated isothermal amplification under different concentrations of loop primers， CH1-CH6 indicate different concentration gradients of loop primers from 10 μmol·L-1to 35 μmol·L-1； B. amplification time and maximum amplification rate under different concentrations of loop primers

3.3 穩(wěn)定性

用新建立的LAMP體系對(duì)不同批次不同時(shí)間提取的6份DNA檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性(圖6)，樣品管的擴(kuò)增效率、濁度之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明該檢測(cè)方法較穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性

用新建立的LAMP體系對(duì)6份同批次DNA檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，且擴(kuò)增效率和濁度2條曲線的重合率極高(圖7)，表明該檢測(cè)方法的重復(fù)性較好。

3.5 靈敏度

梯度稀釋后的銅綠假單胞菌DNA用LAMP和PCR方法檢測(cè)，其最低檢測(cè)濃度分 別 為 2.9×10-7μg·mL-1(圖8：A～C)和2.9×10-4μg·mL-1(圖8：D、E)。

3.6 臨床樣本檢測(cè)

用新建立的LAMP體系擴(kuò)增87份小鼠血清樣本，有10份顯示為銅綠假單胞菌陽(yáng)性，檢出率為11.5%(10/87)，擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green Ⅰ 后，觀察顏色變化(圖9：A)。按照《GB/T 14926.17-2001 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 綠膿桿菌檢測(cè)方法》對(duì)同批次87只小鼠回盲部?jī)?nèi)容物進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果均為陰性。用PCR方法擴(kuò)增LAMP檢測(cè)的10份陽(yáng)性樣本DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂凝膠電泳，均在1 519 bp和504 bp處可見(jiàn)陽(yáng)性條帶(圖9：B、C)。

圖5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測(cè)的特異性Fig. 5 Specificity of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay

A. 不同菌株的LAMP鑒定， B. 熒光鑒定圖， C. 瓊脂糖電泳圖； 1. 銅綠假單胞菌DNA， 2～7分別為鼠傷寒沙門(mén)氏菌、甲型副傷寒沙門(mén)桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌ATCC25923和CMC6003的DNA， 8. 空白對(duì)照， M. DL2000 DNA Marker

A.product identification by LAMP， B. sample fluorescence， C. agarose gel electrophoresis of reaction products； lane 1.PseudomonascaeruginosaDNA product， lanes 2-7.Salmonellatyphimurium，SalmonellaparatyphoidA，Pasteurellapneumotropica，Klebsiellapneumoniae，StaphylococcusaureusATCC25923 and CMC6003 DNA products， 8. control， M. DL2000 DNA Marker

4 討論

與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，LAMP最大的優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)全程均可在恒溫條件下進(jìn)行，避免了溫度循環(huán)的時(shí)間消耗，擴(kuò)增的反應(yīng)結(jié)果肉眼可見(jiàn)(陽(yáng)性結(jié)果呈白色渾濁)，達(dá)到快速檢測(cè)的目的，LAMP的引物是擴(kuò)增技術(shù)的關(guān)鍵(Notomietal.，2000；Yoneyamaetal.，2007)。本研究根據(jù)銅綠假單胞菌(Z50191)的oprL基因序列針對(duì)8個(gè)不同區(qū)域所設(shè)計(jì)的6條特異性引物(Iwamotoetal.，2003；Enomotoetal.，2005；Yamazakietal.，2008)。與GenBank中的銅綠假單胞菌基因序列比對(duì)，該引物還包含其他基因序列，如EU28653、JF901474、JN628780、JN628781、JN628782、JN628828、JN717231、KP056547，顯示出了引物的高度保守性和特異性。此外，對(duì)溫度、內(nèi)引物濃度、環(huán)引物濃度的梯度進(jìn)行優(yōu)化，最終確立最優(yōu)方案如下：溫度66 ℃，內(nèi)引物濃度70 μmol·L-1，環(huán)引物濃度30 μmol·L-1。

圖6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測(cè)的穩(wěn)定性Fig. 6 Stability of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay

A. 樣本的鑒定， B. LAMP擴(kuò)增效率， C. 樣本濁度； 1～6為不同批次不同時(shí)間提取的銅綠假單胞菌的DNA樣本， 7、8為空白對(duì)照

A.product identification， B. LAMP amplification efficiency， C. sample turbidity； 1-6 indicate the different batches at different times ofPseudomonasaeruginosaDNA product， 7 and 8 represent the negative control

圖7 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測(cè)的重復(fù)性Fig. 7 Repeatability of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay

A.樣本的鑒定， B. LAMP 擴(kuò)增效率， C. 樣本濁度； 1～6為同批次的銅綠假單胞菌的DNA樣本， 7為空白對(duì)照， 8為空信號(hào)通道

A.product identification， B. LAMP amplification efficiency， C. sample turbidity； 1-6 indicate the same batch at different times ofPseudormonasaeruginnosaDNA product， 7 represents the negative control， 8. null

用新建立的LAMP體系分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)常見(jiàn)的6種病原微生物和不同批次及同一批次的不同時(shí)間段的銅綠假單胞菌DNA樣本，結(jié)果都顯示了較高的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性；再運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌DNA比較新建立的LAMP體系與PCR方法檢測(cè)結(jié)果的差異，結(jié)果表明，新檢測(cè)體系能檢出的銅綠假單胞菌最低檢測(cè)限為2.9×10-7μg·mL-1，比普通PCR (2.9×10-4μg·mL-1)的靈敏度高出103倍，與已報(bào)道方法(Zhaoetal.，2011)(比普通PCR方法高102倍)比較，其靈敏度更高。

為了評(píng)價(jià)新建立的LAMP方法在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銅綠假單胞菌檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)87份小鼠血清樣本進(jìn)行了檢測(cè)，檢出率為11.5%(10/87)，而利用《GB/T 14926.17-2001 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 綠膿桿菌檢測(cè)方法》的檢出率為0%(0/87)，同時(shí)，16SrRNA和oprL利用PCR方法進(jìn)行陽(yáng)性樣本驗(yàn)證時(shí)，其結(jié)果與LAMP方法檢測(cè)結(jié)果完全一致(10/10)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LAMP檢測(cè)方法比傳統(tǒng)分離培養(yǎng)檢測(cè)方法的檢出率高。在檢測(cè)手段上，《GB/T 14926.17-2001 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 綠膿桿菌檢測(cè)方法》需要各種不同的培養(yǎng)基(如：NAC液體/固體培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基等)，還需要肉眼選擇可疑菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不可控因素也較多。盡管與傳統(tǒng)PCR方法檢測(cè)結(jié)果一致，但新LAMP檢測(cè)體系不需要特殊儀器，操作簡(jiǎn)單，非常適合基層單位，能夠有效地應(yīng)用于人和動(dòng)物的銅綠假單胞菌檢測(cè)，對(duì)保證人及動(dòng)物安全具有重要意義；也為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銅綠假單胞菌的質(zhì)量控制提供了新的、可靠的檢測(cè)方法。

圖8 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測(cè)的靈敏度Fig. 8 Sensitivity of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay

A. 樣本的鑒定， 1～8分別為按照100～10-7稀釋的銅綠假單胞菌DNA； B. 樣本的鑒定， 1為稀釋10-8的銅綠假單胞菌DNA， 2為空白對(duì)照， 3～8為空信號(hào)通道； C. LAMP凝膠電泳圖(M為DL2000 DNA Marker， 2～9分別為按照100～10-8稀釋的銅綠假單胞菌DNA， N為陰性對(duì)照)； D. 16SrRNAPCR凝膠電泳圖(M為DL2000 DNA Marker， 2～10分別為按照100～10-9稀釋的銅綠假單胞菌DNA， N為陰性對(duì)照)； E.oprLPCR凝膠電泳圖(M為DL2000 DNA Marker， 2～10分別為按照100～10-9稀釋的銅綠假單胞菌DNA， N為陰性對(duì)照)

A. product identification， dilutedPseudomonasaeruginosaDNA according to 100-10-7from lanes 1-8； B. product identification， lane 1. diluted 10-8P.aeruginosaDNA， lane 2. control， lane 3-8. null； C. agarose gel electrophoresis of LAMP reaction products (M. DL2000 DNA Marker， lanes 2-9. 10-fold serial dilutions ofP.aeruginosaDNA， lane N. negative control)； D. agarose gel electrophoresis of 16SrRNAPCR amplification (M. DL2000 DNA Marker， lanes 2-10. 10-fold serial dilutions ofP.aeruginosaDNA， lane N. negative control)； E. agarose gel electrophoresis ofoprLPCR amplification (M. DL2000 DNA Marker， lanes 2-10， 10-fold serial dilutions ofP.aeruginosaDNA， lane N. negative control)

圖9 小鼠血清樣本檢測(cè)結(jié)果
Fig. 9 Detection results of mouse serum samples

A. 環(huán)介異等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)陽(yáng)性結(jié)果(1～10為陽(yáng)性樣本)； B. 16SrRNAPCR凝膠電泳圖(M為DL2000 DNA Marker， N為陰性對(duì)照)；C.oprLPCR凝膠電泳圖(M為DL2000 DNA Marker， 1～10為陽(yáng)性樣本， N為陰性對(duì)照)

A. fluorescence result of loop-mediated is othermal amplification (lanes 1-10. positive samples)； B. agarose gel electrophoresis of 16SrRNAPCR amplification (M. DL2000 DNA Marker， lanes 1-10. positive samples， lane N. negative control)； C. agarose gel electrophoresis ofoprLPCR amplification (M. DL2000 DNA Marker， lanes 1-10. positive samples， lane N. negative control)