基于Roche 454 GS FLX高通量測序的葉城沙蜥基因組微衛星特征分析

宋琪， 劉金龍， 郭憲光*

(1.中國科學院成都生物研究所，成都610041； 2. 中國科學院大學，北京100049)

微衛星(microsatellite)又稱為簡短串聯重復(short tandem repeats，STRs)或簡單序列重復(simple sequence repeats，SSRs)，Skinner等(1974)在寄居蟹Paguruspollicaris中發現微衛星DNA序列開啟了對真核生物中微衛星序列的了解。直到Powell等(1996)定義了微衛星位點，認為微衛星DNA序列一般是以1～6個核苷酸為重復單位的串聯重復序列，在從病毒到真核生物的基因組中均有分布，并且具有高度的長度多態性(Zaneetal.，2002)。由于微衛星突變速率快、多態性高、分布廣泛、符合孟德爾遺傳、易于檢測等優點，被廣泛應用于種群遺傳、譜系地理和親子鑒定等領域。據Guichoux等(2011)統計，1990—2009年有關微衛星的論文數量增長迅猛。而開發微衛星標記的傳統方法耗時、耗力(Abdelkrimetal.，2009)，采用高通量測序技術獲得微衛星序列已發展為主流方法(曾聰等，2013；黃杰等，2015；Zhouetal.，2016)。其中，二代測序技術——Roche 454 測序除高效、快捷外，其片段讀長更大，更適合微衛星標記的開發(Allentoftetal.，2009；程曉鳳等，2011)。

葉城沙蜥Phrynocephalusaxillaris隸屬于鬣蜥科Agamidae沙蜥屬Phrynocephalus，是我國特有的一種小型爬行動物，分布于我國新疆天山山脈南部地區，包括塔里木盆地及周邊的吐魯番-哈密盆地和敦煌盆地(趙爾宓等，1999)。其棲息生境為戈壁、荒漠或沙漠邊緣地帶以及固定沙丘的丘間平地(<3 000 m；趙爾宓等，1999)。有關葉城沙蜥種群遺傳結構，利用線粒體基因數據并未得到很好的解析，這可能與其分化時間太短或不完全譜系分選有關(Zhangetal.，2010；李俊，2013)。基于微衛星位點變異速率快、多態性高等特點，有望更全面地解析葉城沙蜥的種群遺傳結構。

葉城沙蜥微衛星標記的研究僅見于Nie等(2015)運用轉錄組測序對青海沙蜥P.vlangalii開展的微衛星位點開發，跨物種在葉城沙蜥中檢測到17個可擴增的微衛星位點。本研究通過Roche 454 GS FLX高通量測序，對葉城沙蜥基因組進行測序，同時用搜索軟件掃描基因組序列，搜索和輸出其微衛星序列。本研究首次對葉城沙蜥核基因組微衛星序列進行了初步的統計和分析，旨在對其基因組水平上的微衛星重復序列的種類、數量等進行初步探索，以期為開發和篩選大量高質量微衛星標記提供數據支持，也為利用微衛星標記研究葉城沙蜥的種群遺傳結構和譜系地理模式奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品收集、基因組DNA提取及Roche 454 GS FLX高通量測序

用于基因組測序的葉城沙蜥標本(標本號：WGXG08226)于2008年6月采于新疆維吾爾自治區吐魯番沙漠植物園(89.19°E，42.86°N)，經75%乙醇固定后，保存于中國科學院成都生物研究所兩棲爬行動物標本館。其肝臟組織樣品固定于95%乙醇中，-20 ℃保存。2013年11月將提取的基因組DNA送上海美吉生物信息科技有限公司，采用基于焦磷酸測序法的高通量基因測序系統——Roche 454 GS FLX進行基因組測序。

1.2 數據分析

采用Roche 454 GS FLX系統對測序數據進行過濾、整理，使用Newbler 2.6(Roche，2011)對優化后的原始數據從頭拼裝(denovoassembly)，并將組裝出的contigs和未拼裝的single read序列合并。采用Krait(Duetal.，2018)對合并的總序列進行微衛星位點的查找，所使用的搜索標準如下：單堿基重復≥9次，其他堿基重復(二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基)≥5次，其余參數采用默認設置。

2 結果與分析

2.1 測序數據統計

原始測序數據的每條read經過質量過濾后，對下機數據進行統計，得到91 190條reads，共47 982 924 bp，最短的27 bp，最長的1 168 bp，平均長度為526.2 bp，主要集中分布在550～750 bp(圖1)。

2.2 基因組組裝

利用Newbler對reads拼接，得到715個contigs，共359 650 bp，最短的100 bp，最長的15 025 bp，平均為503 bp。未拼接上的reads有65 873個，共34 820 132 bp。

2.3 微衛星位點分析

將組裝出的contigs和未組裝的single read序列合并，得到合并序列66 588個，共35 179 782 bp。對合并的總序列進行微衛星位點分析，獲得微衛星重復序列29 890個。重復類型最多的為單堿基重復類型，占總重復類型的48.95%；其次是二堿基重復類型，占28.60%；最少的為六堿基重復類型，僅占0.32%(表1)。

圖1 Roche 454 GS FLX原始數據長度分布統計Fig. 1 Distribution of the sequence length for the raw reads data in Roche 454 GS FLX

A～C″代表不同的序列長度范圍 A to C″ means different ranges of sequence length； A. 1～40， B. 41～60， C. 61～80， D. 81～100， E. 101～120， F. 121～140， G. 141～160， H. 161～180， I. 181～200， J. 201～220， K. 221～240， L. 241～260， M. 261～280， N. 281～300， O. 301～320， P. 321～340， Q. 341～360， R. 361～380， S. 381～400， T. 401～420， U. 421～440， V. 441～460， W. 461～480， X. 481～500， Y. 501～520， Z. 521～540， A′. 541～560， B′. 561～580， C′. 581～600， D′. 601～620， E′. 621～640， F′. 641～660， G′. 661～680， H′. 681～700， I′. 701～720， G′. 721～740， K′. 741～760， L′. 761～780， M′. 781～800， N′. 801～820， O′. 821～840， P′. 841～860， Q′. 861～880， R′. 881～900， S′. 901～920， T′. 921～940， U′. 941～960， V′. 961～980， W′. 981～1 000， X′. 1 001～1 020， Y′. 1 021～1 040， Z′. 1 041～1 060， A″. 1 061～1 080， B″. 1 081～1 140， C″. 1 141～1 180

表1 不同重復類型的完美型微衛星在葉城沙蜥基因組的分布Table 1 Distribution of perfect microsatellites for different repeat types in the genome of Phrynocephalus axillaris

2.3.1各重復拷貝類型的數量和相應的比例同一種類型的重復序列中，各重復拷貝類型所占的比例不相同(表2)。二堿基重復類型中，AC重復拷貝類型最多，占二堿基重復序列總數的54.94%，有4 697個，其次是AG(37.20%)和AT(6.84%)，CG最少，只有87個，占1.02%。三堿基重復類型中，有 9種重復拷貝類型，數量較多的是ATC和AAT，分別有588個和498個，占三堿基重復序列總數的18.78%和15.90%，其他類型詳見表2。四堿基重復類型的重復拷貝類型有27種，最多的是AAAT，有1 288個，占四堿基重復序列總數的40.16%，其次是ATAG，占15.06%，其他類型相對較少，占比均不超過10%。五堿基重復類型中，AAAAT重復拷貝類型最多，有87個，占五堿基重復序列總數的31.75%；其次是AAAAC(16.42%)、AATAG(5.11%)、AAAAG(4.01%)，其他類型均不超過10個。六堿基重復類型中，最多的是AATCCC，有20個，占六堿基重復序列總數的20.62%，其他類型均不超過20個。

表2 葉城沙蜥基因組中分布頻率最高的微衛星重復類型Table 2 The most frequent microsatellite motifs detected in the genome of Phrynocephalus axillaris

2.3.2各種重復類型微衛星拷貝數的數量分布二堿基重復為5～186次，主要分布在5～9次，有6 248個，占二堿基重復類型總數的73.08%；三堿基重復為5～36次，主要分布在5～10次，有2 162個，占三堿基重復類型總數的69.03%；四堿基重復為5～43次，主要分布在5～14次，共2 625個，占四堿基重復類型總數的81.85%；五堿基重復為5～11次，共261個，占五堿基重復類型總數的95.26%；六堿基重復為5～17次，主要分布在5～9次，共87個，占六堿基重復類型總數的89.69%(圖2)。

數量最多的前11個完美型微衛星重復類型依次是C、A、AC、AG、AAAT、ATC、AT、AAT、ATAG、AGG、AAC，這些微衛星在基因組中均出現400次以上，占完美型微衛星總數的89.96%。

圖2 葉城沙蜥不同重復類型微衛星拷貝數的分布Fig. 2 Distribution of the copy number in different microsatellite motifs for Phrynocephalus axillaris

3 討論

由于單堿基重復難以準確測定(Sunetal.，2006)，通常在分析開始就被舍棄(Kimetal.， 2008)。本研究表明，除單堿基重復外的所有重復類型中，二堿基重復最多，這與大熊貓Ailuropodamelanoleuca和北極熊Ursusmaritimus(李午佼等，2014)、褐菖鲉Sebastiscusmarmoratus(Songetal.，2017)和團頭魴Megalobramaamblycephala(曾聰等，2013)等類似。這可能與微衛星序列越長、突變率越高、穩定性越差有關(Wierdletal.，1997)。在很多真核生物中，重復長度和重復頻率呈負相關(Kattietal.，2001)。本研究發現隨拷貝數增加，重復序列數量變少，也符合這一整體趨勢。此外，AC重復是葉城沙蜥基因組中二堿基重復中最多的類型，占54.94%，同時也是除單堿基重復外所有重復類型中最多的一類。脊椎動物基因組的30%～67%微衛星重復是二堿基重復，而AC重復是最多的一種(Tóthetal.，2000)，本研究結果也支持了此觀點。

表3 分布頻率最高的重復類型微衛星的拷貝數分布Table 3 Distribution of the copy repeats number of the most frequent microsatellite motifs

二代測序出現前，對于非模式生物，微衛星重復類型的獲得均是一個瓶頸(Guichouxetal.，2011)。隨著高通量測序技術的發展，測序成本逐漸降低，可獲得的數據越來越多，這為進一步增進對非模式物種的深度了解提供了契機。Nie等(2015)運用高通量測序技術對青海沙蜥進行轉錄組測序，鑒定、篩選出25個微衛星位點，其中17個可在葉城沙蜥中擴增；而經Bonferroni校正后，其中有9個顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.01)，且這些位點的擴增適用性及多態性尚未在葉城沙蜥的不同種群中驗證。本研究使用高通量測序技術對葉城沙蜥進行基因組SSR分子標記開發及分析，并基于Krait(Duetal.，2018)對基因組中完美型微衛星進行統計，深化了對葉城沙蜥基因組的認識和了解，并為下一步開發和篩選大量高質量微衛星標記提供數據支持，還為利用微衛星標記研究葉城沙蜥種群遺傳結構和譜系地理模式奠定了基礎。