結直腸癌中HMGA2表達的意義與微衛星不穩定性的關系

興成娟 陳素賢 李倫 萬義增

(1錦州醫科大學，遼寧 錦州 121000；2錦州醫科大學附屬第三醫院病理科)

結直腸癌早期無明顯癥狀，大多數患者發現時已是中晚期，其治療主要以外科手術為主，輔以放化療，但效果往往不盡如人意。微衛星不穩定性(MSI)是結直腸癌的發病機制之一，大約占15%散發性結直腸癌的發病病因〔1〕。MSI由錯配修復基蛋白(MMR)缺失造成。目前，主要應用于臨床檢測的MMR蛋白包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS2。高遷移率族蛋白(HMGA)2是近年發現的與腫瘤發生、浸潤、轉移有密切關系的DNA結合蛋白，在多種惡性腫瘤細胞中均有表達〔2〕。本文探討HMGA2與MSI的相關性及與結直腸癌患者臨床病理參數之間的關系。

1 材料與方法

1.1研究對象 取自2015年9月至2016年12月錦州醫科大學附屬第三醫院病理科結直腸癌手術新鮮標本及對應常規石蠟70例，年齡46～72歲，平均59歲，配對正常腸黏膜(距癌5 cm以上)新鮮組織及對應常規石蠟20例。均經病理學診斷給予證實。研究對象具有完整病例，均為原發腫瘤，術前未經抗腫瘤治療。

1.2主要試劑 兔抗人HMGA2多抗購自英國Abcam公司；即用型鼠抗MLH1、MSH2、MSH6和PMS2單抗均購自福州邁新生物技術開發有限公司；免疫組化二抗pv9000試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑試劑盒均購自北京中杉生物技術有限公司；RAPI組織裂解液、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；Western印跡其他相關試劑購自碧云天生物技術研究所。

1.3方法

1.3.1免疫組化 HMGA2一抗稀釋濃度為1∶200，抗原修復液使用pH8.0 EDTA，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照，乳腺癌組織作陽性對照，實驗步驟按照說明書操作。結果判定：雙盲法由兩位病理醫師根據陽性細胞染色強度及陽性細胞占所有細胞百分比乘積雙向評估，HMGA2細胞核無染色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分，陽性細胞百分比≤5%為0，6%～25%為1，26%～50%為2，51%～75%為3，>75%為4，乘積0為陰性，1～3為弱陽性表達，4～8為中等陽性表達，9～12為強陽性表達〔3〕。無表達和弱陽性表達歸為弱表達，中等陽性及強陽性表達歸為強表達。MSI結果判斷：MLH1、MSH2、MSH6和PMS2均以腫瘤細胞核部分或全部出現棕黃色染色為陽性表達，若MLH1、MSH2、MSH6和PMS2均為陽性表達，則判定為微衛星穩定(MSS)，若其中任何一個指標陰性表達，則判定為低頻微衛星不穩定(MSI-L)，若其中任何≥2個指標陰性表達，則判定為高頻微衛星不穩定(MSI-H)，腸癌組織做陽性對照。

1.3.2Western印跡法 以總蛋白提取試劑盒說明為準在新鮮標本中提取總蛋白，BCA法定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，PVDF轉膜，HMGA2一抗稀釋濃度1∶2 000，增強化學發光法(ECL)顯影，Image J軟件對條帶進行灰度分析，β-肌動蛋白(β-actin)為內參，重復試驗三次，計算蛋白表達水平。

1.4統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗、方差分析或t檢驗。

2 結 果

2.1免疫組化結果

2.1.1HMGA2在結直腸癌組織和正常腸黏膜組織中的表達 HMGA2陽性表達主要位于細胞核內，呈現棕黃色或棕褐色細顆粒狀染色，見圖1。HMGA2在70例結直腸癌組織中的陽性率為65.71%(46/70)，而在20例正常腸黏膜組織中不表達或弱表達，兩組比較差異顯著(χ2=26.883，P=0.000)。

圖1 HMGA2在正常腸黏膜與結直腸癌組織的表達(DAB，×200)

2.1.2HMGA2在結直腸癌中的表達與臨床病理參數間的關系 HMGA2的表達與腫瘤分化程度和患者遠處轉移有關。在高、中、低分化癌組織中HMGA2的陽性率差異有統計學意義(P=0.039)；發生遠處轉移的HMGA2的表達率與無遠處轉移的表達率差異有統計學意義(P=0.007)，見表1。

2.1.3結直腸癌中MSI的檢測結果 通過檢測MSI相關蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表達，判定為MSI-H組12例，發生率為17.14%(12/70)，MSI-L組7例，發生率為10.00%(7/70)，MSS組51例，發生率為72.86%(51/70)(圖2)。其中年齡46～59歲MSI-H發生率顯著高于60～72歲(P=0.044)；MSI-H右半結腸發生率與左半結腸發生率差異有統計學意義(P=0.023)。此外，MSI-H發生與腫瘤分化高低關系密切(P=0.016)。見表1。

表1 HMGA2、MSI與結直腸癌臨床病理參數之間的關系(n)

圖2 MSI相關蛋白表達(DAB，×200)

2.1.4HMGA2在MSI-H組、MSI-L/MSS組的表達情況 MSI-H組HMGA2陽性率為41.67%(5/12)，MSI-L/MSS HMGA2陽性率為70.68%(41/58)，兩組比較差異無統計學意義(χ2=2.531,P=0.111)。

2.2Western印跡結果

2.2.1HMGA2蛋白在結直腸癌組織和正常腸黏膜組織中的表達量 HMGA2蛋白條帶在分子量12 kD處顯影，內參β-actin蛋白條帶在分子量43 kD處顯影。經軟件統計分析，HMGA2的蛋白表達量在正常腸黏膜和結直腸癌分別為(0.069±0.025)、(0.447±0.098)，差異顯著(t=-50.297，P<0.001)，見圖3。

圖3 不同分組中HMGA2蛋白的表達量

2.2.2HMGA2蛋白表達量與腫瘤分化及臨床分期的關系 高分化組、中分化組、低分化組HMGA2的蛋白表達量分別為(0.393±0.079)、(0.444±0.093)、(0.503±0.097)，表達呈上升趨勢，兩兩比較差異均有統計學意義(F=16.571，P<0.05)，見圖4。TNMⅠ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期的表達量分別為(0.442±0.095)、(0.501±0.094)，差異有統計學意義(t=-3.000，P<0.05)，見圖5。

圖4 不同分組中HMGA2蛋白的表達量

圖5 不同分期中HMGA2蛋白的表達量

3 討 論

本實驗結果提示臨床檢測HMGA2可預測腸黏膜病變情況。通過分析HMGA2與臨床病理資料的相關關系，發現癌組織分化程度越低、臨床分期越晚則HMGA2表達越高，說明HMGA2陽性表達與結直腸癌惡性程度相關，提示HMGA2可能參與促進結直腸癌的發生及惡性趨勢轉變過程。但本研究結果與前人研究〔4〕結果存在差異。Wang等〔4〕研究發現HMGA2僅在發生遠處轉移的結直腸癌組織中差異表達，而與患者年齡、性別、腫瘤分級、位置、浸潤深度、淋巴結轉移和臨床分期均無關，與徐廣甍〔3〕、Rizzi等〔5〕報道一致。高小平〔6〕研究表明，結直腸癌腫瘤浸潤深度越深，分化程度越差及TNM分期越晚，有淋巴結轉移則HMGA2表達越高，亦說明HMGA2在結直腸癌的發生及進展過程中具有重要的促進作用。各組研究結果不盡相同的原因可能是樣本來源的地域、種族、腫瘤異質性及樣本數量有所不同而造成差異。

MSI是目前臨床上用于判斷結直腸癌預后及指導治療的重要指標，多項研究指出MSI結直腸癌患者存在相對獨特的臨床特征，但報道不一仍存在爭議。本研究結直腸癌MSI發生率低于李新霞等〔7〕研究數據，其中MSI-H發生率17.14%，與大量報道的平均值較為接近。Fujiyoshi等〔8〕對2 219例結直腸癌患者進行研究，發現MSI-H好發于女性，近端結腸多于遠端結腸，黏液腺癌多較見，與年齡、腫瘤大小、TNM分期均相關，與Kim等〔9〕研究相似。本實驗顯示，MSI-H好發生于右半結腸，與年齡及腫瘤分化程度有關，與Ismael等〔10〕研究結果一致。本研究結果可為臨床個體化、精確化治療提供借鑒。造成實驗結果不同的原因可能是因為目前MSI的檢測方法沒有統一標準，可采用聚合酶鏈反應(PCR)檢測，也可用免疫組化檢測，或是選擇研究對象存在偏倚，從而影響實驗結果。

錯配修復蛋白缺失及腫瘤細胞中某些基因突變是MSI發生的重要原因。研究發現，人類結直腸癌MSI的發生與激活轉化生長因子(TGF)-β/Smads信號通路中的轉化生長因子受體關系密切〔11,12〕。本研究說明HMGA2的表達與微衛星狀態無關，提示HMGA2可能通過TGF-β/Smads信號通路之外的其他途徑發揮作用。最近研究表明，HMGA2作為啟動子結合到白細胞介素(IL)11的-2147/-2132區域并激活轉錄，通過STAT3信號途徑誘導腫瘤侵襲轉移〔13〕，間接證明了我們的觀點。

總之，HMGA2在腫瘤形成及進展中發揮重要作用，HMGA2及MSI在結直腸癌中作用及相關性的研究還處于組織階段，后期將對其進行細胞學研究，對二者的深入研究能為結直腸癌的發病機制提供更多的理論基礎，為結直腸癌的篩查、治療尋找新的標靶。