蟲草提取物CS-4對他克莫司所致大鼠胰腺和腎臟損傷的保護

張隆業 金健 金吉哲 鄭海蘭 樸尚國 姜玉姬 李慧瑛 金英順 李燦

(延邊大學附屬醫院腎病學科，吉林 延吉 133000)

作為一種強有力的免疫抑制劑，他克莫司(TAC)已廣泛應用于臟器移植、自身免疫性疾病、結締組織病、難治性腎病綜合征的治療。然而，TAC的使用常被其毒副作用所限，譬如腎毒性和移植術后新發糖尿病(NODAT)〔1,2〕。TAC急性腎毒性被認為是可逆的，而TAC慢性腎毒性可導致不可逆的、進行性的腎衰竭且需透析治療〔3〕。TAC慢性腎毒性以炎性細胞浸潤、腎小管間質纖維化(TIF)為病理特點，其發病機制尚不完全清楚，炎性介質、轉化生長因子(TGF)-β1、氧化應激、細胞凋亡與其中扮演重要角色〔4,5〕。NODAT是臟器移植后常見的嚴重并發癥，發病率高達60.2%〔6〕。在諸多發病病因中，TAC所致 NODAT高達36.6%〔7〕。本課題組曾報道TAC可直接損傷胰腺β細胞，而氧化應激起關鍵作用〔5〕。

冬蟲夏草(CS)是一種傳統中草藥，富含氨基酸、微量元素、核苷酸、多肽等生物活性物質，故具有降糖、免疫調節、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等特性〔8～12〕，在環孢素A腎小管損傷〔13〕、2型糖尿病(DM)〔14〕、膜性腎小球腎炎〔15〕、單側輸尿管結扎模型〔16〕中均得到證實。本實驗利用TAC誘導的大鼠糖尿病腎病(DN)動物模型，探討CS是否對胰腺和腎臟具有保護作用。

1 材料和方法

1.1動物分組與藥物治療 體重匹配(體重240～260 g)的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(Charles River,Technology,韓國)，喂飼低鹽飼料(0.05% sodium,Teklad Premier,Madison,WI,美國)1 w后，隨機分為4組：①正常對照組(VH,n=8):正常大鼠皮下注射橄欖油(1 ml·kg-1·d-1);②VH+CS組(n=8):正常大鼠皮下注射橄欖油，灌胃 CS(5 g·kg-1·d-1，CS原粉(西安濟民金水寶制藥有限公司提供CS原粉，Cs-4)溶于飲用水中至5 g/ml濃度，CS劑量選擇基于以往報道〔17〕);③TAC組(n=8):正常大鼠皮下注射TAC(1.5 mg·kg-1·d-1，Prograf,AstellasPharma,Ibaraki,日本)在橄欖油(Sigma,St Louis,MO,美國)中稀釋至1.5 mg-1·ml濃度);④TAC+CS組(TAC+CS,n=8):正常大鼠皮下注射TAC，灌胃CS。治療4 w后分別處死大鼠，收集血液、尿液、腎組織標本以備進一步檢測。該動物實驗獲得韓國加圖立大學動物倫理委員會批準(CUMC-2016-0101-03)。

1.2基本檢測 定期測量并記錄各組大鼠的體重，定量酶比色法(Stanbio Laboratory,Boerne,TX,美國)測定腎功能〔血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)〕及24 h尿蛋白排泄率(Modular DPP system,Roche,Hamburg,德國)，液相色譜-質譜聯用法(LC-MS/MS)檢測全血TAC 濃度；尾動脈測壓法測定大鼠收縮期血壓(BP-2000,Visitech system,Apex,NC,美國)。

1.3胰腺功能評估 在實驗末期測定糖耐量試驗(IPGTT)并計算葡萄糖曲線下面積(AUCg)；酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血漿胰島素水平(Millipore corpotation,St.Charles,Mo)；常規免疫組化法檢測胰島素免疫活性，采用彩色圖像自動分析儀(Polygon program,TDI Scope Eye Version3.5 for Windows;Olympus,日本)高倍鏡下半定量分析。

體外測定葡萄糖刺激下的胰島素水平：糖促胰島素分泌(GSIS)，方法簡述如下：首先將分離的胰島用Krebs-ringer 緩沖液(KRB：NaCl 130 mmol/L;KCl 3.6 mmol/L;CaCl21.5 mmol/L;MgSO40.5 mmol/L;KH2PO40.5 mmol/L;NaHCO32.0 mmol/L;HEPES 10 mmol/L)沖洗后，再用含有25 mmol/L葡萄糖的KRB液處理30 min，并收集上層液。最后用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒(Millipore Corp.,St.Charles,MO,美國)測量上清液胰島素濃度。工作流程見圖1。

圖1 體外動物實驗檢測胰島素水平的工作流程圖

1.4腎臟病理組織檢查 腎組織由過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液(PLP)固定，石蠟包埋后切片，行Masson trichrome三色染色，自動圖像分析儀高倍鏡下分析TIF程度，每個標本至少觀察20個非重疊區域并取平均數。

1.5免疫組化染色 石蠟包埋切片置二甲苯脫蠟，梯度酒精中脫水，37℃、0.3% 過氧化氫/甲醛處理30 min后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次。置微波爐中加熱行微波抗原修復(98℃ 5 min)，室溫下非免疫性血清封閉液20 min。在4℃下滴加 ED-1 單克隆抗體(Serotec Inc.,英國)孵育12～16 h。PBS洗3次后滴加二抗，室溫孵育2 h。以二氨基聯苯胺(DAB)為底物顯色,呈棕黃色為止。自來水流水洗滌，復染蘇木素，常規樹脂封片。染色程度用數字化顯微鏡分析儀(TDI Scope Eye Version 3.0 for Windows,Olympus,日本)，Polygon程序算出每0.5 mm2染色面積的百分比。

1.6雙重免疫熒光染色 胰島素和 caspase-3 雙重染色步驟如下：一抗孵育洗滌后加入生物素化―抗兔 IgG 孵育，洗滌并滴加 SABC-Cy3 復合物，熒光顯微鏡下觀察特異性熒光，再進行異硫氰酸熒光素(FITC)―抗小鼠 IgG(二抗)孵育，最后封片觀察。

1.7血、尿 8-羥脫氧鳥苷(8-OHdG)水平 根據試劑盒操作步驟，用酶聯競爭免疫吸附法測定血、尿 8-OHdG DNA 加合物水平(Cell BIOLABS,San Diego,CA,美國)。

1.8免疫印跡法 腎組織用蛋白質裂解液制成勻漿，室溫下離心后取上清液測蛋白濃度(Bio-Rad，Hercules)，鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；電轉膜2 h后，4℃下置〔單核細胞趨化蛋白(MCP)-1,Santa Cruz Biotechnoogy,Inc.,美國〕于非脂牛乳中以1∶1 000濃度孵育12～16 h，室溫下PBS洗3次，加辣根過氧化物酶標記的驢抗兔 IgG(Amersham)1 h；室溫下PBS洗3次，增強發光(ECL,Amersham)和曝光。以對照組為標準(100%)測定條帶的光密度，以 β-actin校正。類似方法測定白細胞介素(IL)-17,Cell signaling Technology,Danvers,MA,美國)；轉化生長因子-β1(TGF-β1,R&D Systems,Minneapolis,MN,美國)；TGF-β 1誘導基因-h3(βig-h3,Proteintech,Chicago,IL,美國)；錳超氧化物歧化酶(MnSOD,Abcam)；B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2,Millipore,Billerica,Mass)，活性的含胱氨酸的天冬酸蛋白水解酶-3(Caspase-3，Millipore,Billerica,Mass)，Bcl-2相關X蛋白(Bax,Millipore,Billerica,Mass)。

1.9原位缺口末端標記(TUNEL)法 根據 ApopTag in Situ Apoptosis Detection Kit(Millipore)試劑盒操作步驟測定細胞凋亡，200高倍下數字化顯微鏡分析儀計數TUNEL陽性細胞。

2 結 果

2.1CS 對生化參數的影響 TAC 組大鼠表現為體重下降、腎功能低下(Scr和BUN升高)、24 h尿蛋白排泄率增加，而尿量(UV)和飲水量(WI)卻升高。CS 治療阻滯體重下降、腎功能低下、尿蛋白排泄率增加，然而對UV和WI無明顯改善。見表1。

2.2CS 對胰腺功能的影響 給予大鼠 TAC 可誘導 DM，表現為 IPGTT和AUCg較VH組上升(P<0.05)；反之，血漿胰島素和GSIS水平卻下降(P<0.05)。CS均使上述指標逆轉。胰島免疫組化(圖2)顯示，與VH組比較，TAC 抑制胰島的胰島素免疫活性〔(6.9±1.4)vs(14.6±0.8)μm2×103,P<0.05〕， CS 治療顯著增加胰島素的免疫活性〔(12.3±1.1)μm2×103,P<0.05 vs TAC組〕。見表2。

表1 冬蟲夏草對生化指標的影響

△BW：體重增加量；UV：尿蛋白；SBP：收縮壓；與VH組比較：1)P<0.05；與TAC組比較：2)P<0.05，下表同

表2 各組間血糖和胰島素水平

2.3CS對腎小管間質炎癥反應的影響 腎小管間質炎癥反應在TAC慢性腎毒性中起關鍵作用，因為炎癥先于纖維化。TAC治療4 w導致腎小管間質炎癥，表現為炎性介質MCP-1和IL-17的表達增加(P<0.05)，繼之ED-1陽性細胞在腎小管間質大量浸潤〔(23.1±2.5)% vs(0.5 ± 0.06)%,P<0.05,圖3A〕。CS治療不僅下調MCP-1和IL-17的表達(P<0.05，圖3B)；而且明顯減少ED-1陽性細胞數〔(14.8 ± 1.8)%,P<0.05 vs TAC組〕。以上結果表明，CS對TAC慢性腎毒性具有抗炎作用。見表3。

圖2 胰腺免疫組化和半定量分析(×400)

圖3 ED-1免疫組化(A,×400)和MCP-1、 IL-17免疫印跡(B)

2.4CS 對腎小管間質纖維化的影響 帶狀TIF 是TAC慢性腎毒性特征性的病理改變，這種變化在TAC組腎組織中顯得尤為突出(P<0.05)。病理上的變化伴隨著明顯的TGF-β1及其誘導基因 βig-h3較VH組高表達(P<0.05；圖4A)。CS治療顯著下調TGF-β1和βig-h3的表達(P<0.05；圖4B，表4)，改善了TIF程度(P<0.05)。見表3。

圖4 Masson's trichrome染色(A,×400)和 TGF-β1、βig-h3免疫印跡(B)

組別胰島半定量分析(μm2×103)腎臟ED-1陽性細胞(個/0.5 mm2)TIF(%/mm2)血清8-OHdG表達量 (ng/ml)24小時尿中8-OHdG排泄量(ng/24 h)胰島 TUNEL 染色陽性細胞數(個/mm2)胰島 Caspase-3陽性細胞數(個/mm2×104)腎臟TUNEL染色陽性細胞數(個/mm2)Vh組14.6±0.81.0±0.10.0±0.01.4±0.195.0±18.00.8±0.22.6±0.50.6±0.1CS組15.2±1.41.1±0.20.0±0.01.9±0.2125.3±18.00.5±0.23.9±1.01.0±0.1TAC組6.9±1.41)23.3±3.31)10.8±2.41)3.0±0.11)220.0±12.01)8.9±0.81)20.0±4.81)10.4±2.11)TAC+CS組12.3±1.11)2)14.8±1.81)2)5.5±2.31)2)1.5±0.52)151.1±16.22)3.6±0.62)7.7±0.92)5.2±1.22)

表4 各種免疫印跡檢測表達量

2.5CS 對氧化應激的影響 與VH組相比，TAC組血、尿 8-OHdG水平明顯增加(P<0.05)；相反，抗氧化因子MnSOD蛋白的表達卻減少(P<0.05)，CS治療均使上述各項指標逆轉。見表3，表4，圖5。

2.6CS 對細胞凋亡的影響 TAC增加胰腺和腎組織內的TUNEL陽性細胞數(P<0.05)，而CS治療減少其在胰腺和腎的數量(表3)。在分子水平上，雙重免疫熒光染色示胰島素和Caspase-3僅在TAC組胰島中融合顯影，提示胰島細胞凋亡與胰島素減少緊密相關(表3)。在腎組織中，CS調節Bcl-2/Bax比值和下調caspase-3蛋白的表達(P<0.05)，以利于細胞存活(表4)。見圖6，圖7。

圖5 血、尿 8-OHdG 水平和MnSOD免疫印跡

圖6 胰腺 TUNEL 染色(A，×400)和胰島素及caspase-3 雙重免疫熒光染色(B，×400)

圖7 腎臟 TUNEL 染色(A,×400)和 細胞凋亡相關基因免疫印跡(B)

3 討 論

在鏈脲佐菌素誘發的DM大鼠模型和高脂飼料誘導的2型DM模型(C57BL/6J 小鼠)中，CS可發揮強有力的降糖作用，其降糖作用機制可能與刺激胰島素分泌和激活膽堿酯酶有關〔18,19〕，說明在 DM 疾病中，CS 具有降糖作用。本實驗結果與上述報道吻合，CS 明顯增加胰島素的分泌和GSIS上升，從而降低 TAC 所致高血糖(包括IPGGT 和 AUCg)。此外，CS 明顯減少胰島細胞凋亡、保持胰島大小的完整性。因此，不難推斷 CS 是通過抑制胰島細胞凋亡機制發揮降糖作用，對 TAC 所致胰腺損傷具有保護作用。

CS 對膜性腎小球腎炎和2型 DN 具有抑制炎性介質(如MCP-1 和 ICAM-1)的表達，減少巨噬細胞浸潤，下調 TGF-β1 表達，防止細胞外基質沉積(Ⅳ型膠原蛋白)等效能〔15，20〕。上述證據表明在腎臟疾病中，CS 具有抗炎、抗纖維化作用。本研究利用 TAC 誘導大鼠 DN 模型，闡明 CS 對其保護的分子作用機制。本文結果表明 CS 明顯下調炎性介質 MCP-1、IL-17 的表達，隨之減少炎性細胞在腎小管間質的浸潤(ED-1 陽性細胞數)。此外，CS 下調致纖因子 TGF-β1 和細胞外基質成分之一βig-h3 的表達。這種分子水平上的變化伴隨著24 h尿蛋白排泄率減少、腎功能改善、腎小管間質帶狀纖維化的減少。此結果與以往報道〔21〕中CS發揮的腎臟保護作用極為相似，表明 CS 在 TAC 誘導的大鼠 DN 模型中，通過抑制 MCP-1、IL-17、TGF-β1 的表達，從而減少腎小管間質炎癥反應和纖維化，發揮腎臟保護作用。

本研究結果闡明CS對TAC所致的胰腺和腎臟損傷具有保護作用，但其作用機制可以是多方面的，至少兩種可能性參與其中。首先是氧化應激損傷，因為長期使用TAC對胰腺 β 細胞和腎近曲腎小管上皮細胞株(NRK 52E)具有增強氧化應激損傷、減少抗氧化物質的作用〔5,21〕，而CS 通過調控活性氧、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛等水平，改善腎功能〔22〕。其次是細胞凋亡，因為TAC可直接導致胰腺β細胞和腎小管細胞凋亡，而CS 通過抑制細胞凋亡途徑緩解高脂飲食或脂多糖所致的胰腺和腎臟損傷〔23〕。在本實驗中，CS不僅減少血、尿8-OHdG水平、增加MnSOD的表達，而且調節細胞凋亡調控基因，從而減少胰腺和腎實質細胞凋亡。因此，CS改善TAC相關的DM和腎損傷與其抗氧化應激、抗細胞凋亡能力緊密相關。

在臨床實際中，使用非腎毒性的藥物有效控制 NODAT 具有深遠意義，因為 NODAT 可直接損傷腎移植患者的移植物。除了像胰島素、二甲雙胍這樣的一線 DM 藥物外，近年來不斷涌現出新研發的藥物如二肽基肽酶-4和鈉-葡萄糖共轉運體-2抑制劑。然而，這些新藥亦帶來不可避免的副作用，譬如低血糖、泌尿系和生殖器感染、胃腸道功能紊亂〔24,25〕。因此，無副作用的傳統中草藥越來越受到人們青睞。大量證據證實，CS可改善腎移植患者的慢性移植腎病、肝毒性、哮喘癥狀、心血管疾病等〔26～28〕。以上效能結合本實驗結果，我們可以大膽假設，對臟器移植患者早期服用 CS 可獲得意想不到的益處。綜上所述，在 TAC 誘導的 DN 大鼠模型中，CS可降低血糖，減少蛋白尿，改善腎功能，具有良好的胰腺和腎臟保護作用。這將為臨床上使用 CS 防治 DN 提供有力的分子理論基礎。