TLR4、MyD88和NF-κB在大腸癌中的表達及意義

孫振玉 陳學軍

(錦州醫科大學病理教研室，遼寧 錦州 121000)

大腸癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，其發病率居全球第三位，每年有超過一億人被診斷為結直腸癌，有超過600 000例患者死于該病〔1〕。在我國居惡性腫瘤死因的第五位。最近研究發現致炎因子Toll樣受體(TLR)4和其介導的髓樣合化因子(MyD)88依賴性通路及其下游的一重要因子核因子(NF)-κB，在大腸癌的發生發展中起重要作用。激活TLR4-MyD88-NF-κB信號通路可啟動固有性免疫和獲得性免疫反應，并在腫瘤的形成過程中扮演重要角色。TLR4、MyD88、NF-κB與肺癌、肝癌、卵巢癌等的發病關系密切〔2,3〕,但是三者同時在大腸癌中的檢測卻鮮有報道。本文作者通過檢測TLR4、MyD88、NF-κB在大腸癌組織、腺瘤組織和相應癌旁正常組織中的表達情況，進一步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機選取2015年3月至2016年9月錦州醫科大學附屬第一醫院病例完整的70例大腸癌手術存檔蠟塊，所有患者經術后病理學確診為大腸癌，術前均未接受化療和放療。其中男38例，女32例；年齡41～88(平均63.5)歲；其中高、中分化49例，低分化及未分化21例；70例病例中有28例發生淋巴結轉移；根據TNM分期，Ⅰ、Ⅱ期42例，Ⅲ、Ⅳ期28例。同時選取經病理學證實的36例大腸腺瘤和癌遠端5 cm正常組織20例。

1.2方法 采用免疫組化PV-6000法，切片經脫蠟水化后，微波爐抗原修復15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍，過氧化氫(H2O2)室溫封閉15 min，PBS洗3遍，滴加稀釋的一抗：TLR4 1∶100，MyD88 1∶150,NF-κB 1∶300,4℃過夜。取出PBS洗3遍，滴加二抗，37℃孵育35 min，PBS洗3遍，二氨基甲聯苯胺(DAB)顯色2～5 min。蘇木素染色、脫水、透明、封片。用已知的陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗。

2 結 果

2.1TLR4、MyD88和NF-κB在大腸癌組織、腺瘤、癌旁正常組織中的表達 在70例大腸癌組織中，TLR4、MyD88、NF-κB的表達陽性率均顯著高于腺瘤組織、正常黏膜組織(χ2=34.503，60.457，60.457，均P<0.001)。見表1。TLR4陽性表達于細胞膜和(或)細胞質中，在癌旁組織和腺瘤中表達較少或不表達；MyD88免疫定位于細胞質中，在癌旁組織和腺瘤中表達較少或不表達；NF-κB表達于細胞質和(或)細胞核中，在癌旁正常大腸黏膜組織和腺瘤中表達較少或不表達。見圖1。

表1 TLR4、MyD88、NF-κB在大腸癌旁正常黏膜、腺瘤、腺癌中的表達陽性率比較〔n(%)〕

與腺癌組比較：1)P<0.001

圖1 TLR4、MyD88和NF-κB在不同大腸黏膜組織中的陽性表達(DAB，×200)

2.2TLR4、MyD88和NF-κB在不同臨床特征大腸癌組織的陽性表達 TLR4、MyD88和NF-κB的陽性表達與大腸癌患者的性別、年齡、腫瘤部位無關(P>0.05);與腫瘤細胞的分化程度、淋巴結轉移及TNM分期有關(P<0.05)。見表2。

表2 TLR4、MyD88和NF-κB在不同臨床特征大腸癌組織中的陽性表達(n)

2.3大腸癌中TLR4及MyD88、 NF-κB蛋白陽性表達的相關性 TLR4與 MyD88在大腸癌組織中的陽性表達呈正相關(r=0.474，P<0.05)，TLR4與NF-κB在大腸癌組織中的陽性表達呈正相關(r=0.435，P<0.05)。

3 討 論

近年來，TLR4、MyD88及NF-κB在大腸癌中的作用備受關注，成為研究的熱點。TLR4是第一個被發現的人類Toll樣受體，是Toll樣受體家族的成員之一。1997年Medzhitov等〔4〕首次在人身上發現與果蠅同源的Toll樣蛋白及其受體，命名為TLR,現稱為TLR4。人類TLR4是Ⅰ型跨膜蛋白識別受體，可分為胞膜外區，胞質區和跨膜區三部分。TLR4在組織中分布比較廣泛，可見于淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、脾細胞、樹突狀細胞、小腸上皮細胞、人子宮平滑肌細胞、呼吸上皮細胞〔5〕。TLR4在被活化后，可激活兩條信號通路：MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑。其中MyD88依賴性途徑又經一系列活化，最終激活MAPKs家族(Jun信號通路及p38信號通路)和NF-κB信號通路，其中NF-κB信號通路，細胞靜息狀態下在胞質中與抑制蛋白IκB以無活性三聚體形式存在，當細胞受到外界刺激后IκB發生磷酸化并降解，NF-κB被釋放進入細胞核啟動相關基因的轉錄，并刺激炎癥因子如白細胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α的釋放，引發炎癥反應刺激免疫應答,同時釋放的炎癥因子如IL-1、TNF-α等又可以作為激活物激活NF-κB，由此形成反饋機制周而復始〔6〕。研究顯示脂多糖(LPS)與TLR4結合可以使缺氧誘導因子(HIF)-1α和血管內皮生長因子(VEGF)的表達上調，繼而促進腫瘤的生長、侵襲和轉移〔7〕。TLR4的激活可以增加前列腺素E2、環氧化物酶(COX)-2的表達，增強表皮生長因子受體(EGFR)信號，促進炎癥相關性癌的發生發展〔8〕。在APCMin/+的自發性腸癌的鼠模型提示〔9〕，MyD88信號通路可促進腫瘤的生長及進展，對鼠進行皮下腫瘤注射沉默腫瘤細胞中的TLR4/ MyD88信號，不僅可以減少腫瘤生成而且可以延長其生存期。研究顯示在大腸癌中持久性表達的TLR4可以特異性地激活NF-κB，尤其是在腫瘤起源細胞，NF-κB通過炎癥和組織修復機制延續信號，來維持腫瘤的生長及進展〔10〕。

本研究結果顯示TLR4、MyD88及NF-κB在大腸癌中的陽性表達率均比正常組織及腺瘤組織高；且三者之間關系密切，進一步表明其在大腸癌中的相互促進作用。Wang等〔11〕檢測發現TLR4、MyD88在大腸癌(CRC)的表達高于正常黏膜和癌旁組織,高表達的TLR4、MyD88有利于腫瘤細胞的免疫逃逸，促進腫瘤細胞增殖、浸潤轉移，與腫瘤生長、侵襲及肝轉移有密切關系。高表達的TLR4、MyD88及TLR4/MyD88提示患者5年無病生存期(DFS)和總生存期(OS)均低，提示患者生存期短且預后不良。還發現TLR4/MyD88在肝轉移的大腸癌患者中高表達。TLR4、MyD88的高表達促進腫瘤的生長、增殖，其致癌作用不僅體現在炎癥相關性大腸癌，在散發性大腸癌中也扮演重要角色。NF-κB的激活與大腸癌發生轉移擴散相關。Huang等〔12〕通過組織取樣、大腸癌SW260細胞系及裸鼠異種移植模型來檢測TLR4/NF-κB的表達，研究發現上調NF-κB p65的表達，在SW260細胞系中發現增加了炎性因子IL-6、IL-8的分泌，血清中IL-6、IL-8的水平增高與大腸癌的進展關系密切。本研究結果與先前的研究結果基本一致。在本研究中TLR4、MyD88和NF-κB在大腸癌中的表達均與性別、年齡、腫瘤部位無關，而與大腸癌的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移密切相關，提示三者在大腸癌的生長發展、侵襲浸潤中發揮重要作用。TLR4、MyD88和NF-κB是腫瘤的早期事件，慢性感染與炎癥是腫瘤形成的重要因素，研究表明大約有15%的大腸患者是由炎性腸病進展而來的，而三者通過參與免疫反應而加強并擴大了炎癥效應，使其在向腫瘤發展方向更加推進一步〔13〕。但由于TLR4-MyD88-NF-κB在組織中表達廣泛，涉及信號通路繁多復雜，作用正反同存，其具體在組織中與其他因子的協同作用仍需進一步探究，三者在腫瘤標志物方面的潛力需進一步證實，相關抑制劑、治療藥物仍需進一步試驗。