Six1基因在肺癌組織表達水平及RNA干擾抑制其表達后對肺癌細胞生物學特性的影響

劉志廣 韓江紅 李寧

(1新鄉市中心醫院胸瘤一科，河南 新鄉 453000；2新鄉醫學院三全學院；3河南中醫學院第一附屬醫院呼吸內科)

肺癌是常見的高發病率和死亡率的惡性腫瘤，雖然通過大量研究，肺癌的診斷、治療有了一定的進展，但其療效仍不盡人意〔1〕。腫瘤的形成和惡性轉化與癌基因的激活、抑癌基因的失活等密切相關。Six1(Sine oculis homeobox homolog1)定位于人14q23染色體，是新近發現的一個同源盒基因，在多種物種間表現出高度保守性，參與耳、眼、肌肉和神經系統等組織器官的發育，可通過調節下游多種基因的表達影響腫瘤的發生發展〔2〕。目前在結直腸癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤中發現Six1高表達，Six1的高表達可促進腫瘤增殖、上皮間質轉化、遷移等〔3～5〕。這些研究提示Six1可能是一種癌基因。然而，Six1對肺癌生物學特性的影響還未明確。本研究檢測了肺癌組織中Six1的表達情況，并通過小干擾RNA抑制Six1的表達，觀察細胞的增殖凋亡情況，進一步研究誘導細胞增殖凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1組織樣本 收集新鄉市中心醫院2014年6月至2016年3月胸外科手術切除的肺癌及相應的癌旁組織(距離腫瘤邊緣1～3 cm)標本各62例。肺癌均經過病理學檢查證實，且術前均未行放化療。病理類型均為腺癌。其中男42例，女20例，中位年齡59歲。組織標本手術切除后置于液氮罐中保存備用。所有標本的采集均經過患者及家屬的知情同意。

1.2細胞及試劑和儀器 人肺癌A549細胞，中科院上海細胞庫;胎牛血清、脂質體LipofectamineTM2000試劑盒、RPMI1640細胞培養基，購自美國Sigma；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、CCK8試劑盒均購自中國碧云天試劑公司；膜聯蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙錠(PI)細胞凋亡試劑盒、流式細胞儀，購自美國BD公司；Six1、細胞增殖核抗原(PCNA)、B細胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)、Notch1和Hes1抗體，購自美國abcam公司；酶標儀購自美國Bio Tek公司；凝膠成像系統購自美國PE公司。

1.3Six1基因在肺癌組織表達 組織蛋白提取試劑盒提取肺癌及癌旁組織中的總RNA，按照BCA試劑盒操作說明測定總蛋白濃度，30 μg的上樣蛋白，加入所需的5倍蛋白上樣緩沖液，混合均勻后100℃變性8 min，立即置于4℃冷卻，12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳跑膠(濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓100 V)，電泳結束后轉膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Six1(1∶500稀釋)和內參GAPDH(1∶1 000稀釋)抗體，4℃搖床緩慢搖動過夜，洗膜，加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG，洗膜。增強化學發光法(ECL)發光試劑盒檢測，實驗重復3次。

1.4細胞培養及siRNA轉染 A549細胞用含有10%胎牛血清及青鏈霉素雙抗的RPMI1640細胞培養基，置于37℃、5% CO2條件下傳代培養。轉染參照脂質體LipofectamineTM2000轉染說明進行操作。細胞分為空白組、陰性對照(NC)組和 Six1-siRNA組。空白組細胞中加入脂質體，NC組和 Six1-siRNA組分別加入合成的無義siRNA序列和 Six1的靶向siRNA序列。轉染前1 d，以3×104/ml細胞密度接種于24孔細胞培養板中，細胞生長融合度約80%時進行轉染。收集轉染48 h的細胞，Western印跡檢測各組細胞Six1蛋白表達。

1.5CCK8法檢測Six1-siRNA轉染對肺癌細胞增殖的影響 取生長至對數期的各組細胞，制備細胞懸液，每孔100 μl(含5×104個細胞)接種至96孔板中，常規培養，分別于24 h、48 h和72 h在每孔細胞中加入CCK8溶液，視細胞生長狀況和顏色變化繼續孵育2 h，酶標儀檢測波長為570 nm時的光密度(OD)，記錄結果，實驗重復3次。

1.6流式細胞術檢測Six1-siRNA轉染對肺癌細胞凋亡的影響 以每孔1×105個細胞將各組A549細胞接種至6孔板，每孔添加2 ml，常規培養48 h，胰蛋白酶消化細胞，預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，收集細胞沉淀，結合緩沖液重懸細胞，加入5 μl的Annexin V-FITC，混合均勻后室溫避光反應10 min，再加入5 μl的PI，室溫避光孵育5 min，1 h內上流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。

1.7PCNA、Bax、Notch1和Hes1蛋白表達檢測 收集轉染48 h的細胞，加入適量的細胞裂解液提取細胞中的蛋白，按照1.3方法檢測各組細胞中PCNA、Bax、Notch1和Hes1的蛋白相對表達量。

1.8統計學方法 采用SPSS21.0軟件，計量資料多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1Six1在肺癌組織的表達 Six1在癌旁組織及肺癌組織中的蛋白表達分別為(0.102±0.010)、(0.511±0.047)，肺癌組織中Six1的表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)。見圖1。

圖1 Six1在肺癌組織及癌旁組織的表達

2.2轉染Six1-siRNA的A549細胞Six1的表達 空白組、NC組和Six1-siRNA組Six1的蛋白表達分別為(0.383±0.036)、(0.381±0.035)、(0.177±0.015)，NC組Six1的蛋白表達與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)，而Six1-siRNA組Six1的蛋白表達顯著低于空白組(P<0.05)。見圖2。

圖2 轉染Six1-siRNA的肺癌細胞Six1的表達

2.3轉染Six1-siRNA對A549細胞增殖凋亡的影響 與空白組比較，Six1-siRNA組細胞24～72 h的細胞增殖均顯著降低(P<0.05)，在48 h的細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.4轉染Six1-siRNA對A549細胞PCNA、Bax、Notch1和Hes1蛋白表達的影響 與空白組比較，Six1-siRNA組PCNA、Notch1和Hes1的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表1，圖3。

表1 轉染Six1-siRNA后A549細胞增殖、凋亡率及PCNA、Bax、Notch1、Hes1蛋白表達量比較

與空白組比較:1)P<0.05

圖3 轉染Six1-siRNA對A549細胞PCNA、ax、Notch1和Hes1蛋白表達的影響

3 討 論

Six1是Six蛋白家族成員，在成人組織中含量較低，過量表達可導致腫瘤的發生〔6〕。目前已發現在多種腫瘤中出現Six1的過表達。Six1的表達上調可促進癌細胞增殖及細胞向上皮間質的轉化〔7,8〕，這提示在多種腫瘤中Six1可能以腫瘤蛋白的作用存在。為了檢測肺癌中Six1的作用，本文首先檢測了肺癌組織中Six1的表達，發現肺癌組織中也存在Six1的高表達，這說明Six1可能影響肺癌的發生發展。有研究發現，結直腸癌中Six1的高表達可增強癌細胞的增殖能力〔9〕；上調宮頸癌中Six1的表達可增強腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，且使G2/M期縮短，而下調其表達后癌細胞的增殖及侵襲能力均明顯降低〔10〕；下調骨肉瘤細胞Six1的表達可明顯抑制腫瘤細胞的增殖和遷移能力〔11〕。以上研究提示抑制Six1的表達可降低腫瘤的發生發展。RNA干擾能特異、高效地抑制目的基因表達，是目前研究基因功能的新方法，已得到廣泛的應用〔12〕。本研究中將Six1的siRNA轉染肺癌細胞，通過CCK8法和流式細胞術分別檢測細胞增殖及凋亡情況，發現Six1的表達受到抑制后，肺癌細胞的增殖明顯降低、凋亡率增加。這提示Six1在肺癌中也是癌基因。

肺癌的發生涉及多種癌基因和抑癌基因。PCNA是DNA合成不可缺少的因子，在細胞增殖過程中起重要作用，可作為評價惡性腫瘤增殖的良好指標〔13〕，目前也應用于肺癌增殖的檢測〔14〕。Bax為Bcl-2家族成員之一，發揮促凋亡作用，與腫瘤的發生發展及預后密切相關〔15〕。肺癌中Bax表達上調可引起癌細胞凋亡〔16〕。本研究抑制Six1的表達后檢測PCNA、Bax的表達，發現PCNA表達受到抑制、Bax表達上調，這說明Six1對肺癌細胞增殖凋亡的影響可通過調節PCNA、Bax的表達而實現。在多種腫瘤中Notch1信號通路過度表達，如肺癌、結直腸癌等，影響腫瘤的發生發展〔17,18〕。有研究發現，下調肺癌中Notch1信號可降低肺癌的增殖及誘導細胞凋亡〔19〕。本研究為了證實Six1對肺癌增殖凋亡的影響是否通過影響Notch1信號通路，通過Western印跡檢測Notch1信號通路Notch1及下游靶基因Hes1的蛋白表達，發現Notch1和Hes1的表達均明顯降低。

綜上所述，抑制肺癌細胞Six1的表達后可降低癌細胞增殖，誘導細胞凋亡；下調Notch1信號通路、抑制細胞增殖及誘導凋亡的方式是下調PCNA表達和上調Bax表達。