恒古骨傷愈合劑通過PI3K/AKT/GSK-3β信號通路治療樹鼩絕經后骨質疏松的作用機制

鄭紅 趙宏斌 袁鑫 吳超 角建林 唐薇

(昆明醫科大學 1實驗動物學部，云南 昆明 650500；2第一附屬醫院；3技術轉移中心)

骨質疏松(OP)是一種全身代謝性骨骼疾病，其特征是骨量減少、骨骼微觀結構退化，最終導致骨脆性增加，使患者易于發生骨折〔1,2〕。絕經后骨質疏松(PMOP) 是由于女性絕經以后機體雌激素水平下降而引發的〔3〕，是OP中最重要的一種形式，病人年齡通常界定在50～70 歲。PMOP在中醫上屬 “骨痿、骨痹”的范疇，而腎虛是其根本原因。中醫理論認為腎藏精，主骨生髓〔4〕，因此，骨骼的生長、發育及修復等功能均依賴于腎中精氣的蓄存和滋生。源自云南彝藥的恒古骨傷愈合劑(OK)，是我國擁有自主知識產權的民族藥物。OK主要由三七、紅花、陳皮、杜仲等中草藥配制而成，具有滋陰益腎、補腎溫陽、補脾益氣、氣血雙補等功效，符合中藥治療PMOP的藥理學需求〔5,6〕。在本次研究中，筆者將最接近靈長類的實驗動物樹鼩去除卵巢創建PMOP模型，評價OK的促骨形成作用及對PMOP的治療效果，特別是其對在成骨細胞增殖和分化過程中起重要作用的信號通路磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/糖原合成酶(GSK)-3β所起的調控作用。

1 資料與方法

1.1實驗動物 60只12月齡雌性滇西亞種樹鼩，體重100～120 g，昆明醫科大學實驗動物學部提供，生產許可證號：SCXK(滇)K2013-0002，使用許可證號：SYXK(滇)K2015-0002。所有樹鼩單籠飼養，實驗室溫度 20～25℃，濕度控制在20%～30%，自由攝食、飲水，實驗動物基礎顆粒飼料和水果混合飼料喂養，適應性喂養2 w后用于實驗。

1.2實驗藥品及主要試劑 OK(由三七、黃芪、人參、紅花、杜仲、鱉甲、陳皮等配方制成,每毫升中生藥含量為 0.36 g)由云南克雷斯天然藥物制藥廠生產，國藥準字：Z20025103；結合雌激素片(新疆新姿源生物制藥有限責任公司，批號20130802)；雌二醇(E2)、骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(OC)和I型原膠原N-端前肽(PINP)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RNA總提取試劑盒(北京Tiangen公司)；第一鏈逆轉錄試劑盒(美國Promega公司)；引物基因合成(美國Invitrogen公司)；熒光PCR染料混合液(瑞士Roche公司)；PI3K、AKT、GSK-3β和 β-actin一抗(美國Cell Signal Technology公司)；相應辣根酶標記的二抗(北京中杉金橋公司)；電化學發光法(ECL)發光試劑盒(美國Millipore公司)。

1.3主要儀器和設備 紫外分光光度計及電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；瑞士羅氏cobas c 311全自動生化分析儀；全波段酶標儀(Thermo fisher公司)；低溫離心機(德國Eppendorf公司)；垂直電泳系統(美國Bio-Rad公司)；7300實時熒光定量 PCR儀(美國 ABI公司)；Prodigy-BX IL雙能X線(DXA)骨密度(BMD)測量儀(美國Lunar公司)。

1.4分組及給藥 60只實驗樹鼩中隨機選取10只作為正常組(不做任何處理)，剩余50只去除兩側卵巢(樹鼩全身BMD檢測下降25%)作為PMOP模型動物，再隨機分為模型組(每天生理鹽水灌胃)，OK低、中、高劑量組(分別給予OK 0.5、1.5和3.0 ml/d灌胃治療)，陽性藥對照組給予1.5 ml/d 結合雌激素灌胃治療)，每組10只。10 w后處死樹鼩。

1.5BMD檢測 各組樹鼩腹腔注射水合氯醛麻醉，俯臥位固定于DXA BMD測定儀實驗臺上，拉直脊柱后行DXA測定BMD。

1.6標本收集 實驗樹鼩處死前禁食不禁水12 h，稱量并記錄體重后，腹腔注射3.6%水合氯醛(1 ml/100 g)，心臟采血，室溫放置1～2 h后，3 500 r/min離心10 min，收集血清，取右側下肢鈍性分離，剝離干凈皮膚和肌肉組織，生理鹽水洗凈骨頭后，置于液氮中速凍，取出溶解，如此重復3次后，研磨成粉漿狀存于-80℃保存備用。

1.7血生化相關指標檢測 各組樹鼩取血清，使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒測定E2、BALP和OC、PINP的含量，具體步驟按照試劑盒說明進行操作。

1.8RT-qPCR檢測相關指標mRNA表達水平 取各組樹鼩右下肢骨組織，經液氮速凍和反復研磨好的骨組織約100 mg超聲粉碎，Trizol提取總RNA，定量后反轉錄為隨機 cDNA，加入引物及熒光染料進行擴增。反應條件：95℃預變性2 min；95℃變性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸35 s，循環40次，72℃最后再延伸5 min。結果采用RT-qPCR 相對擴增分析法 2-ΔΔCt法進行統計分析，每組實驗至少重復3次。引物設計見表1。

表1 引物設計序列

1.9Western印跡檢測相關指標蛋白表達水平 取出研磨好的骨組織約1 g，加入RIPA組織裂解液和蛋白酶抑制劑(PMSF)勻漿，蛋白定量后沸水浴約15 min，每個樣品取50 μg進行十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠電泳，半干法轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗4℃過夜，二抗孵育2 h，加入化學發光試劑 ECL顯色，曝光，以β-actin作為內參，掃描圖像，用Image J軟件計算各條帶的吸光度值，每組實驗至少重復3次。

1.10統計學分析 采用SPSS19.0軟件，兩組間計量資料比較采用t檢驗，多組計量資料比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1OK對各組體重和E2的影響 與正常組比較，模型組體重明顯變高，具有統計學意義(P<0.05)；而藥物灌胃治療后體重略有下降，但與模型組相比差異無統計學意義(P>0.05)。與正常組比較，模型組E2含量下降明顯，經OK灌胃治療后，E2含量逐漸升高，表現出劑量依賴性，且與模型組相比，OK中劑量與高劑量組治療效果具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.2OK對BMD的影響 與正常組〔(0.23±0.02)g/cm2〕相比，模型組BMD〔(0.13±0.01)g/cm2〕降低明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，治療10 w后，各治療組BMD逐漸增加〔OK低、中、高劑量組分別為(0.14±0.01)、(0.18±0.01)、(0.22±0.02)g/cm2〕，且隨OK劑量增加，治療效果更加明顯；此外，陽性藥對照組BMD〔(0.18±0.02)g/cm2〕也升高明顯，與OK中劑量組效果相當。

表2 各組體重及E2含量、成骨標志物對比

與正常組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；下表同

2.3OK對各組成骨因子的影響 模型組血清BALP、OC和PINP的含量相較于正常組明顯降低(P<0.05)，表明去除卵巢誘導的PMOP樹鼩模型建立成功。經過OK灌胃治療后，各治療組血清BALP、OC和PINP含量都有所增加，呈現出劑量依賴性，特別是OK中、高劑量組治療效果均具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥對照組血清BALP、OC和PINP的含量也有所增加(P<0.05)，療效與OK中劑量相仿，見表2。

2.4OK對PI3K/AKT/GSK-3β信號通路mRNA的影響 模型組PI3K mRNA表達水平(2-ΔΔct值)比正常組明顯降低(P<0.05)，GSK-3β mRNA表達水平比正常組明顯升高(P<0.05)。經過OK灌胃治療后，各治療組PI3K mRNA表達水平明顯升高，GSK-3β mRNA表達水平明顯降低，且效果都呈現出劑量依賴性，特別是OK中、高劑量組差異均具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥對照組PI3K mRNA表達水平也增加(P<0.05)，GSK-3β mRNA表達水平也明顯降低，療效與OK中劑量相仿；而各組AKT mRNA表達水平無明顯變化(P>0.05)，見表3。

2.5OK對PI3K/AKT/GSK-3β信號通路蛋白因子的影響 與mRNA檢測結果一致，模型組PI3K蛋白表達水平比正常組明顯降低(P<0.05)，GSK-3β蛋白表達水平比正常組明顯升高(P<0.05)。OK灌胃治療后，各治療組PI3K蛋白表達水平明顯升高，GSK-3β蛋白表達水平明顯降低，且效果都呈現出劑量依賴性，特別是OK中、高劑量組差異均具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥對照組PI3K蛋白表達水平也增加(P<0.05)，GSK-3β蛋白表達水平也明顯降低，療效與OK中劑量相仿。各組總AKT蛋白表達水平沒有明顯變化(P>0.05)，但AKT的磷酸化(308位點)〔p-AKT cThr 308)〕水平變化明顯，在模型組中AKT的磷酸化水平明顯降低(P<0.05)，而OK灌胃治療后AKT磷酸化水平逐漸升高，呈現出劑量依賴性，與模型組相比，OK中劑量和高劑量組差異具有統計學意義(P<0.05)，見表3，見圖1。

表3 各組PI3K、AKT和GSK-3β mRNA和蛋白水平對比

圖1 各組PI3K、AKT和GSK-3β蛋白表達比較

3 討 論

腎氣虛損和“骨枯” 密切相關，也就是說腎虛是OP的根本病因〔7〕。原發性OP主要發生在絕經后婦女和老年人群中，主要表現為四肢酸軟、腰背疼痛、駝背及易于骨折等。臨床中常用雙膦酸鹽類、降鈣素類及雌激素類藥物治療PMOP，這些藥物主要作用都是抑制骨吸收〔8〕，而促骨形成的藥物相對較少，因此，尋找安全高效經濟的骨形成促進劑是臨床的迫切需求。應用中藥促骨形成治療PMOP適合中國國情，具有較廣闊的應用前景。來自我國云南彝族的民族特色藥物OK 由三七、紅花、陳皮、杜仲等配方制成，為治療骨折、骨病等的內服方藥。本實驗結果顯示，OK具有優良的促骨形成作用。

OK能夠通過促骨形成的作用緩解PMOP，但這種成骨作用是否通過促進細胞增殖的方式目前不得而知，因此，本文也對此進行了研究。包括 PI3K/AKT/GSK-3β和Wnt/β-catenin等在內的多條細胞信號通路調控著細胞的增殖分化，特別是PI3K/AKT/GSK3β信號通路長期以來都是研究細胞增殖和抗凋亡信號領域的熱點〔9〕。作為PI3K下游的直接靶點蛋白,PI3K一旦激活后，可以使磷肌醇類因子發生磷酸化，從而發揮生物活性，特別是PI3K能夠磷酸化AKT的第308位酪氨酸從而激活AKT,因此其是該蛋白質活性的調節樞紐〔10〕。GSK-3β是其下游因子，是體內第一個被發現的AKT作用底物,AKT可使GSK-3β第9位絲氨酸磷酸化,降低GSK-3β的磷酸化水平從而誘導細胞凋亡；GSK-3β 作為 PI3K /AKT 通路下游重要的位點，主要作用是調控糖原的合成與代謝，除此之外其在調控細胞增殖和分化的過程中也發揮了廣泛的作用。GSK-3β 也是Wnt/β-catenin 信號途徑的關鍵因子，可以磷酸化 β-catenin 的絲氨酸/蘇氨酸殘基，進而促進 β-catenin 被泛素化降解，調控骨細胞的增殖〔11,12〕。本實驗發現，OK能夠上調PI3K的表達水平和AKT的磷酸化水平，并且下調GSK-3β的表達水平，這與實驗初期的假設是一致的，說明OK可以通過促進骨細胞增殖的作用緩解PMOP，并且這種治療作用可能是通過調控PI3K/AKT/GSK-3β信號通路實現的，但其具體分子機制還需進一步研究。