靶向抑制乳腺癌細胞GLS1基因表達對癌細胞凋亡的影響

賴明華 楊嵐淞

(云南省第一人民醫院 1乳腺甲狀腺外科，云南 昆明 650032；2消毒供應中心)

乳腺癌在女性腫瘤中發病率居首位〔1〕。研究表明，多種惡性腫瘤的發生發展是一個由多基因、多階段參與的復雜過程，目前已發現多個用于乳腺癌預防和治療的靶基因〔2〕。谷氨酰胺酶(GLS)1是谷氨酰胺-谷氨酸循環途徑中的限速酶，可通過分解谷氨酰胺而提供腫瘤細胞快速增殖所需的重要能量來源〔3〕。在結直腸癌、乳腺癌等腫瘤中發現GLS1基因的過度表達，GLS1表達影響結直腸癌的發生發展，抑制其表達可降低結直腸癌的增殖活力〔4，5〕。有研究發現，乳腺癌中GLS1的表達與患者生存率有關〔6〕。本研究試圖證實GLS1對乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器 RPMI1640培養基、青鏈霉素、胰蛋白酶、胎牛血清均購自美國Bibco；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)試劑購自Sigma-Aldrich公司；膜聯蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙錠(PI)細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自碧云天公司；GLS1、p53、survivin、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、磷酸化的絲氨酸蘇氨酸激酶(p-AKT)抗體購自美國Cell signal公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2細胞培養及GLS1的siRNA轉染 人MCF-7乳腺癌細胞購自美國ATCC細胞庫。細胞在37℃，5%CO2的飽和濕度培養箱中用RPMI1640培養液(含血清及青鏈霉素)進行傳代培養，實驗為生長良好的第3代細胞。轉染實驗參照LipofectamineTM2000說明書，分別將合成的GLS1 siRNA及無干擾作用的siRNA轉染MCF-7細胞，分別標記為GLS1-siRNA組和陰性對照組，細胞中僅加入脂質體的為空白對照組。收集轉染48 h的細胞用于檢測GLS1表達。

1.3Western印跡 細胞轉染48 h后收集細胞，細胞中加入適量的RIPA裂解液裂解細胞30 min，提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，每泳道取等量上樣蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離，分離后轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%的脫脂奶粉封閉，4℃孵育一抗過夜，其中GLS1、p53、survivin、PI3K、p-AKT蛋白皆按1∶500稀釋，內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)按照1∶1 000稀釋，洗膜2次，室溫孵育二抗〔1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G〕1 h，洗膜，滴加電化學發光(ECL)試劑曝光顯影。

1.4GLS1-siRNA轉染對MCF-7細胞活力的影響 采用MTT法檢測各組細胞活力。GLS1-siRNA轉染MCF-7細胞24、48、72 h后，在每個細胞孔中加入MTT(5 mg/ml)溶液20 μl，常規培養于培養箱內4 h，吸棄上清液，每孔加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩混勻10 min，酶標儀在波長490 nm處測定每孔的吸光度值(A值)。實驗重復3次。

1.5GLS1-siRNA轉染對MCF-7細胞凋亡的影響 各組細胞凋亡檢測采用Annexin V-FITC/PI雙染法，利用流式細胞儀檢測。收集GLS1-siRNA轉染48 h的細胞，磷酸鹽緩沖液洗滌細胞3次，胰酶消化后將細胞密度調整為每毫升含1×106個細胞，結合緩沖液懸浮細胞，加入FITC標記的Annexin V和PI各5 μl，避光室溫孵育20 min，流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。實驗重復3次。

1.6統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1GLS1-siRNA轉染MCF-7細胞后GLS1的蛋白表達 GLS1-siRNA組GLS1蛋白表達(0.168±0.021)顯著低于空白對照組(0.617±0.072，P<0.05)，陰性對照組(0.629±0.075)與空白對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 GLS1-siRNA轉染MCF-7細胞后GLS1的蛋白表達

2.2GLS1-siRNA轉染降低MCF-7細胞活力 GLS1-siRNA組細胞在轉染24、48和72 h后細胞活力均顯著低于空白對照組(P<0.05)。見表1。

表1 GLS1-siRNA轉染對MCF-7細胞活力的影響值，n=3)

與空白對照組比較：1)P<0.05；下表同

2.3GLS1-siRNA轉染誘導MCF-7細胞凋亡 與空白對照組比較，GLS1-siRNA組細胞凋亡率顯著升高，survivin蛋白表達顯著降低，p53的蛋白表達顯著升高(均P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 Western印跡檢測GLS1-siRNA轉染后MCF-7細胞survivin和p53的蛋白表達

組別凋亡率(%)survivinp53空白對照組1.36±0.250.378±0.0450.134±0.015陰性對照組1.45±0.280.362±0.0410.121±0.013GLS1-siRNA組11.77±1.321)0.182±0.0231)0.347±0.0421)F/P值171.145/0.00025.173/0.00167.155/0.000

2.4GLS1-siRNA轉染下調MCF-7細胞PI3K/AKT信號通路 與空白對照組比較，GLS1-siRNA組PI3K和p-AKT蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。見圖3，表3。

圖3 GLS1-siRNA轉染對MCF-7細胞PI3K/AKT信號通路的影響

組別PI3Kp-AKT空白對照組0.334±0.0380.120±0.015陰性對照組0.356±0.0410.128±0.016GLS1-siRNA組0.153±0.0191)0.046±0.0081)F/P值32.037/0.00133.754/0.001

3 討 論

多種癌癥發病的分子機制涉及抑癌基因表達的下調和癌基因表達的上調。腫瘤的分子靶向治療已成為腫瘤治療熱點，大多數腫瘤的靶向治療是針對各種信號通路中的癌基因，然而，對腫瘤細胞代謝分子的調節也可能是一種潛在的治療靶點〔7，8〕。谷氨酰胺是在腫瘤細胞中消耗最多的一種氨基酸，其代謝可產生加快細胞增長所需的原料〔9〕。GLS1在谷氨酰胺代謝中發揮重要作用，在人體腫瘤中表達廣泛，在多種腫瘤中發揮促腫瘤細胞增長的作用〔10〕。有研究顯示，抑制膠質瘤中GLS1基因表達可降低細胞的生長〔11〕。

已有研究顯示乳腺癌中GLS1有高表達〔5〕。由于RNA干擾技術可在染色質水平及轉錄和翻譯水平對基因的表達進行調節，且有很強的序列特異性，在基因的腫瘤治療中也有廣泛的應用〔12，13〕，本文提示GLS1可影響乳腺癌細胞的增殖和凋亡。促凋亡基因和抑凋亡基因均可影響乳腺癌細胞的凋亡，p53是一個發現較早的癌癥相關抑癌基因，可調節細胞周期及促進細胞凋亡，在包含乳腺癌在內的多種腫瘤中均有研究〔14〕。survivin具有調節細胞周期、促增殖和抗凋亡的功能，在多種腫瘤中表達升高，survivin可作為乳腺癌預后判斷指標，抑制乳腺癌中survivin的表達可降低細胞增殖及促凋亡〔15，16〕。本文結果提示GLS1可通過調節p53和survivin的表達影響乳腺癌細胞的凋亡。PI3K/AKT信號通路在多種人類腫瘤表達失調，如乳腺癌、卵巢癌等，影響腫瘤的發生發展〔17，18〕。乳腺癌中PI3K/AKT信號通路的活化率較高，抑制該通路可降低乳腺癌的增殖及誘導凋亡〔19〕。本文結果提示GLS1可通過下調PI3K/AKT信號通路影響乳腺癌的發生發展。

綜上，通過RNA干擾抑制GLS1基因在乳腺癌中的表達可降低癌細胞活力，促進細胞凋亡，下調PI3K/AKT信號通路，其中誘導細胞凋亡的方式是下調survivin表達和上調p53表達。GLS1基因可能成為乳腺癌治療有價值的工具。