山楂葉與三七葉有效部位組合物對兔全腦缺血再灌注損傷的保護作用

溫富春 紀鳳蘭 劉博 王鑫 丁濤 宋俐霏 徐惠波

(1吉林省中醫藥科學院，吉林 長春 130021；2吉林大學化學院)

山楂葉提取物為薔薇科植物山里紅的干燥葉經提取、富集、精制等過程加工制成的總黃酮提取物；三七葉提取物為五加科植物的干燥莖葉經提取、富集、分離等過程加工制成的總皂苷提取物。山楂葉與三七葉有效部位(SS)組合物中主要成分為山楂葉總黃酮和三七葉總皂苷，具有活血祛瘀、通脈活絡之功效,用于缺血性腦卒中恢復期的治療〔1〕。本文觀察SS組合物對家兔全腦缺血再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 SS組合物，吉林省中醫藥科學院新藥中心劑型室提供，批號20140601；血塞通膠囊，云南維和藥業股份有限公司生產，批號：150347。超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒，批號：20150411；丙二醛(MDA)測定試劑盒，批號：20150202；谷氨酸測定試劑盒，批號：20150401；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒，批號：20150402；均購自南京建成生物工程研究所。戊巴比妥鈉，批號：84-06-12，上海化學試劑分裝廠分裝；肝素鈉，批號：110908，中國惠世生化試劑有限公司。上海。

1.2動物 家兔，體重2.5～3.0 kg，雌雄各半，購自長春生物制品研究所有限責任公司，許可證號：SCXK(吉)-2013-0002。

1.3儀器 PowerLab/8s多導生理儀,澳大利亞Adinstruments生產；GF-D800半自動生化分析儀，山東高密彩虹分析儀器有限公司生產；UV-5100型紫外-可見分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司生產；BX51型光學顯微鏡，日本Olypus公司生產；RM2245型石蠟切片機、HI1210型組織烘片機、HI1220型組織攤片機、EG1150H型組織包埋機，均為德國Leica公司生產；101A-2E型電熱鼓風干燥箱，上海實驗儀器有限公司生產；DHP-9082型電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司生產。

1.4實驗方法〔2～4〕取家兔40只適應環境3 d后分為假手術組、模型組、血塞通(21.00 mg/kg)組,SS組合物高、低劑量組(6.370、3.185 mg/kg)，每組8只，灌胃給藥7 d,末次給藥1 h后，用3%戊巴比妥鈉麻醉后剃凈頭、頸部及四肢的毛。將兔仰位固定，于喉頭下緣與第一肋上緣之間沿頸腹正中線做切口，分離氣管，插管以保持呼吸通暢；分別分離左右頸內、頸外動脈，穿線備用；再于雙側鎖骨下緣分離皮下組織，尋找椎動脈，穿線備用；分離左側股動脈，插管，連接血壓探頭測血壓，分離右側股動脈，插抗凝管備用。待各項指標穩定后，記錄正常血壓值之后用動脈夾夾閉雙側頸外、頸內動脈、結扎雙側椎動脈，使六動脈同時結扎，造成兔全腦缺血(假手術組不阻斷血供)，同時于右側股動脈緩慢抽血并抗凝，直至平均血壓降為40 mmHg。持續缺血30 min時取下頸外、頸內動脈上的動脈夾使之再灌注，同時于耳緣靜脈回輸自體抗凝血。在再灌注2 h時于耳緣靜脈取血后將動物實行安樂死，立即取腦，橫斷面取5 mm厚切片，于10%甲苯溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色，于光學顯微鏡下觀察其病理學改變。剩余的腦組織于-80℃冰箱中保存備用。測再灌注2 h血清GSH-PX活力及腦組織SOD活性和MDA、谷氨酸含量。

1.5實驗方法 取兔血清按試劑盒方法測定再灌2 h血清中GSH-PX活力，取腦組織0.1 g,用冰生理鹽水制成10%的腦組織勻漿,4℃離心(3 000 r/min)15 min,取上清，按試劑盒方法測定SOD活性、MDA含量。取兔腦勻漿按試劑盒方法測定腦組織中谷氨酸的含量。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1SS組合物對兔腦缺血30 min再灌2 h血清GSH-PX酶活力的影響 假手術組GSH-Px酶活力為(504.1±79.94)μmol/L，模型組GSH-PX酶活力為(478.1±76.59)，SS組合物高、低劑量組GSH-PX酶活力分別是(612.3±123.60)μmol/L；(637.0±148.68)μmol/L，與模型組比較均能明顯增加血清GSH-PX酶活力(均P<0.05)；血塞通組GSH-PX酶活力為(627.4±135.33)μmol/L，亦能增加GSH-PX酶活力(P<0.05)。

2.2SS組合物對兔腦缺血30 min再灌2 h腦組織SOD、MDA的影響 模型組腦組織中SOD活性明顯低于假手術組，MDA含量明顯高于假手術組。與模型組比較,SS組合物高、低兩個劑量組均能明顯增加家兔腦組織中SOD活性(P<0.01；P<0.05)、降低MDA含量(P<0.01),血塞通組亦能降低腦組織中MDA含量(P<0.05)。見表1。

表1 SS組合物對兔全腦缺血30 min再灌2 h腦組織中SOD、MDA的影響

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.3SS組合物對兔全腦缺血30 min再灌2 h腦組織中谷氨酸含量的影響 模型組家兔腦組織中谷氨酸含量(183.95±19.427)μmol/gprot明顯高于假手術組(145.64±20.273)μmol/gprot(P<0.01)，與模型組比較SS組合物高、低劑量組均能明顯降低腦組織中谷氨酸含量〔(154.86±17.742)μmol/gprot；(162.58±13.831)μmol/gprot〕(P<0.01,P<0.05)。

2.4腦組織病理學(HE染色)檢查結果 光鏡下，假手術組：神經細胞結構完整，血管內皮細胞及血管周圍未見異常；模型組：大面積神經細胞水腫疏松、空泡化，固縮，血管內皮細胞腫脹，毛細血管內有微血栓形成，腦組織內可見梗死灶；血塞通組：大腦中度缺血改變缺血范圍小，固縮神經元較少，毛細血管微血栓、梗死灶面積小于模型組；SS組合物高劑量組：大腦輕-中度缺血改變，較模型組輕、范圍小，腦梗死灶面積明顯比模型組小；SS組合物低劑量組：大腦輕-中度缺血改變，較模型組輕、范圍小，腦梗死灶面積明顯小于模型組，見圖1。

圖1 各組家兔腦組織病理學觀察(HE，×400)

3 討 論

腦組織缺血后再灌注時，灌注使氧大量增加可能產生大量的對腦組織有害的活性氧和自由基，進一步加重腦組織的損傷。自由基水平升高、細胞內的鈣離子超載、興奮性氨基酸過度釋放，造成細胞膜脂質氧化，細胞凋亡，腦神經受到不可逆損傷〔5〕。SOD是人體的氧自由基清除酶,能夠清除機體超氧陰離子自由基，直接阻斷脂質過氧化鏈式反應，保護組織免受自由基損傷，測定SOD活性可反映機體抗氧化能力的變化〔6〕。MDA是生物體內脂質發生過氧化反應的代謝產物，測量MDA含量，可反映機體內氧自由基水平〔7〕。GSH-PX 的主要作用是清除脂類過氧化物和過氧化氫(H2O2)，保護生物膜及生物大分子免受自由基的損害。抗氧化應激作用是中藥發揮治療腦梗死藥效的重要途徑〔8〕。本研究中觀察到，家兔全腦缺血再灌注后兔腦組織中SOD活性明顯降低、MDA含有量顯著升高，說明再灌注后所產生的大量氧自由基使SOD 活性降低，從而加大細胞受損程度，使得MDA含有量升高。SS組合物高、低劑量能夠明顯增加兔腦組織中SOD的活性及血清中GSH-PX酶活力，減少脂質過氧化物MDA的生成，說明了SS組合物可拮抗自由基損害，有利于神經細胞的修復。健康的腦細胞中興奮性和抑制性神經遞質間保持著動態平衡。缺血缺氧能夠打破這種平衡，內源性興奮性遞質谷氨酸會迅速增加，進而導致神經細胞損傷〔9〕。谷氨酸可通過激活N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)受體產生興奮性毒性作用。腦缺血后NMDA受體被激活,導致興奮性氨基酸過度釋放,是缺血性腦損害的關鍵因素之一。因此,抑制興奮性氨基酸的釋放和拮抗其毒性是治療腦缺血再灌注損傷的關鍵之一〔10〕。本研究觀察到SS組合物高、低劑量組能明顯地減少家兔腦組織中的谷氨酸含量,從而可以減輕興奮性氨基酸的損傷。病理學檢查結果提示，SS組合物對家兔全腦缺血再灌注損傷具有保護作用。綜上，SS組合物對家兔全腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，其機制可能與抗氧化和抑制興奮性氨基酸釋放或拮抗興奮氨基酸毒性有關。