芹菜素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827增殖、凋亡的影響及機(jī)制

王林梅 馮青青 齊景憲 邵潤(rùn)霞 尚學(xué)琴

(1鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450014；2云南省第二人民醫(yī)院腫瘤科)

肺癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和致死率極高〔1〕。目前，化療是主要的治療手段，但對(duì)人體副作用較大，故急需尋找高效、副作用小的治療方法。芹菜素(API)是一類黃酮類化合物，在大蒜、芹菜、番石榴等中廣泛分布，其中在芹菜中的含量最高，具有廣泛的藥理作用〔2〕。API在抗腫瘤過(guò)程中具有重要作用，可抗宮頸癌〔3〕、卵巢癌〔4〕、胃癌〔5〕、鼻咽癌〔6〕等，且可減少心肌損傷〔7〕，但對(duì)非小細(xì)胞肺癌作用的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)旨在研究API對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827的生長(zhǎng)和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，API購(gòu)自上海阿拉丁公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)于HyClone公司，噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于Sigma公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物有限公司，兔抗人環(huán)氧化酶(COX)-2一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam，β-actin一抗、β-actin二抗、山羊抗兔二抗均購(gòu)自北京中杉金橋技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 使用含有15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，加入100 μ/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，在37℃，5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)，每2～3 d用2.5 g/L胰酶消化，以1∶3傳代一次。

1.2.2MTT法檢測(cè)API對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827增殖的影響 以每孔4 000個(gè)細(xì)胞加入96孔板中，分別加入不同濃度的API(0、10、20、40、80 μmol/L)，其中0 μmol/L API為對(duì)照，每組設(shè)4個(gè)重復(fù)，分別培養(yǎng)24 h，48 h，72 h后，向每孔中加入20 μl，5 g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入DMSO 100 μl溶解，置于搖床震蕩10 min，直至結(jié)晶完全溶解后，放置酶標(biāo)儀上于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔吸光度值(A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的API(0、10、20、40、80 μmol/L)，每孔1 ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)的指示，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4Western印跡檢測(cè)COX-2蛋白表達(dá) 將待提取蛋白的細(xì)胞中加入20 μl細(xì)胞裂解液，沸水浴5 min，離心后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，取60 μg總蛋白，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，置于5%的脫脂牛奶封閉90 min，加入β-actin一抗(1∶1 000)和兔抗人COX-2一抗(1∶1 500)4℃過(guò)夜，加入β-actin二抗、山羊抗兔二抗(1∶60 000)作用1 h，用TBST洗膜4次，滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液，在凝膠成像系統(tǒng)下測(cè)定灰度值。相對(duì)蛋白表達(dá)量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1API對(duì)HCC827細(xì)胞增殖的抑制作用 API對(duì)HCC827細(xì)胞增殖抑制率呈顯著濃度和時(shí)間依賴性，隨濃度增加及時(shí)間延長(zhǎng)抑制率顯著增加(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2API對(duì)HCC827細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用 隨API濃度的增加，不同時(shí)期凋亡細(xì)胞比例顯著升高，呈現(xiàn)濃度依賴性(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 API對(duì)非小細(xì)胞肺癌HCC827細(xì)胞的增殖抑制作用

與同時(shí)間前一濃度相比：1)P<0.05；與同濃度前一時(shí)間相比：2)P<0.05

表2 API對(duì)非小細(xì)胞肺癌HCC827細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用

與前一濃度比較：1)P<0.05

2.3API對(duì)COX-2蛋白表達(dá)的影響 不同濃度API(0、10、20、40、80 μmol/L)COX-2蛋白表達(dá)分別為：(0.987±0.024)、(0.903±0.036)、(0.843±0.025)、(0.768±0.027)、(0.703±0.031)。隨API濃度增大COX-2蛋白表達(dá)明顯降低(均P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 API對(duì)COX-2蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

非小細(xì)胞肺癌約占原發(fā)性肺癌的80%〔8〕。手術(shù)治療和化學(xué)治療是治療肺癌的傳統(tǒng)手段〔9〕。大部分晚期患者不能實(shí)行手術(shù)治療；化學(xué)治療對(duì)機(jī)體的副作用較大。分子靶向治療和中西醫(yī)藥結(jié)合的方式逐漸成為研究的熱點(diǎn)，但是部分患者會(huì)出現(xiàn)耐藥性，不適合分子靶向治療〔10〕。

API具有多種生物學(xué)活性和藥理作用，其中最受關(guān)注的是其抗腫瘤作用。API能抑制人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞系球細(xì)胞自我更新作用〔2〕；抑制膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞增殖，并通過(guò)線粒體信號(hào)通路誘導(dǎo)其凋亡〔11〕；能夠抑制人肺癌NCI-H1299 細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡〔12〕。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，API能有效抑制非小細(xì)胞肺癌HCC827細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加其抑制效果越明顯。API對(duì)非小細(xì)胞肺癌HCC827細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用，其作用對(duì)時(shí)間和濃度具有依賴性，與抑制增殖的結(jié)果一致。

COX-2于正常機(jī)體中沒(méi)有表達(dá)，其在細(xì)胞發(fā)生病理變化時(shí)會(huì)迅速合成，參與炎癥過(guò)程及腫瘤的發(fā)生〔13〕。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺素合成通路上的關(guān)鍵酶COX-2與肺癌的發(fā)生關(guān)系密切〔14〕，并在非小細(xì)胞肺癌中高度表達(dá)〔15〕。另有研究顯示COX-2通過(guò)抑制凋亡、誘導(dǎo)腫瘤血管生成、抑制免疫功能和腫瘤侵襲等多個(gè)環(huán)節(jié)參與腫瘤的生成〔16,17〕。本研究結(jié)果說(shuō)明API對(duì)COX-2蛋白表達(dá)有明顯抑制作用。

綜上，API作為一種植物提取的天然活性成分，能夠抑制非小細(xì)胞肺癌HCC827細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，有望成為一種新型的、副作用小的抗肺癌藥品，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。