柴胡皂苷d對離體蟾蜍心臟功能的影響

陳靜 孫浪 羅林 鄧歡 廖富源 李春臣 羅倩鈺 陳衛 楊春燕 張建武

(川北醫學院 1藥學院藥物研究所，四川 南充 637007；2麻醉系；3影像學院；4基礎醫學院機能實驗中心)

柴胡始載于《神農本草經》，為傘形科柴胡屬植物，按性狀不同分別習稱北柴胡和南柴胡，其味苦、辛，性微寒，歸肝膽經，具有解表退熱，疏肝解郁，升舉清氣之功效〔1〕。柴胡的化學成分較復雜，迄今為止，已報道其含有皂苷、黃酮、揮發油、甾醇、香豆素、糖類、木脂素、有機酸、多炔類及生物堿等成分，柴胡皂苷是柴胡的主要生物活性成分〔2〕。目前對于柴胡皂苷的化學成分研究較為深入，已從柴胡屬植物中分離出90多種柴胡皂苷，其中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d 含量較高，藥理實驗證明柴胡皂苷d的活性最為明顯〔3〕。近年來的研究表明，柴胡皂苷d的藥理作用較為廣泛，包括抗過氧化損傷、抗纖維化、抗炎、抗腫瘤、保肝、鎮靜及抗癲癇等作用〔4〕。但目前尚未有柴胡皂苷d對蟾蜍心功能影響的報道，本文觀察柴胡皂苷d對蟾蜍心功能的影響，并探討其影響機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康蟾蜍100只，雌、雄不限，體重110～130 g，由川北醫學院實驗動物中心提供，實驗動物許可證編號SYXK(川)2013-076。

1.2藥品、藥材 鹽酸維拉帕米購自上海禾豐制藥有限公司，規格：2.5 mg/ml，批號：43161001；鹽酸腎上腺素購自遠大醫藥(中國)有限公司，規格：1 mg/支，批號：161408；艾司洛爾購自齊魯制藥有限公司，規格：0.2 g/ml，批號：161204。柴胡皂苷d由中國科學院成都生物研究所李甫博士提供；任氏液由川北醫學院機能實驗中心配制。

1.3主要試劑與儀器 肌張力換能器為四川成都泰盟公司生產，電子天平為上海醫用激光儀器廠生產，BL-420生物機能實驗系統為四川成都泰盟公司生產,加樣槍購自芬蘭biohit。

1.4離體蛙心標本的制備 參考文獻〔5〕制備離體蛙心標本。用斯氏法蛙心插管取1只蟾蜍，破壞腦和脊髓，將其背位固定于蛙板上暴露心臟后在左右主動脈下穿一線，將心臟翻至頭端，在背面結扎前后腔靜脈；在左主動脈下穿一線，距動脈圓錐2～3 mm處結扎；再從左右主動脈下方穿一線，打一個活結留作固定插管用。用眼科剪在動脈圓錐前端處向心臟剪一斜口，將盛有林格液的蛙心插管由此口插人心室腔內，連同近旁血管一起結扎固定，將心臟離體；用林格液反復沖洗心室內的余血，至插管內灌流液完全澄清無色后，保持插管內的灌流液1 ml，劃線作標記。

1.5離體蟾蜍心活動記錄 將蟾蜍心經蛙心夾和絲線與肌張力換能器相連，通過BL-420 生物機能實驗系統記錄離體蟾蜍心心搏曲線。

1.6動物分組及給藥 取60只蟾蜍，分為①空白對照組：依次在蛙心套管中加入0.9、0.1 ml林格液；②柴胡皂苷d不同濃度組(實驗組)：在蛙心套管中分別加入0.9 ml林格液和0.1 ml終濃度分別為0.004 5、0.009 0、0.018 0 mmol/L的柴胡皂苷d；③維拉帕米組：在蛙心套管中同時加入0.9 ml林格液和0.1 ml的0.011 0 mmol/L維拉帕米，使維拉帕米終濃度為0.001 1 mmol/L；④維拉帕米+柴胡皂苷d組：先在蛙心套管中加入0.9 ml林格液和0.1 ml的0.011 0 mmol/L維拉帕米，5 min后徹底灌洗，再在蛙心套管中加入0.8 ml林格液、0.1 ml的0.011 0 mmol/L維拉帕米和0.1 ml的0.070 0 mmol/L柴胡皂苷d； ⑤艾司洛爾組：依次在蛙心套管中加入0.9 ml林格液和0.1 ml的0.12 mmol/L艾司洛爾，使艾司洛爾終濃度為0.040 6 mmol/L；⑥艾司洛爾+柴胡皂苷d組：先在蛙心套管中同時加入0.9 ml林格液和0.1 ml的0.406 2 mmol/L艾司洛爾，5 min后徹底灌洗，再在蛙心套管中同時加入0.8 ml林格液、0.1 ml的0.406 2 mmol/L艾司洛爾和0.1 ml 0.070 0 mmol/L柴胡皂苷d，每組10只。用BL-420生物機能實驗系統測定每次給藥后5 min內離體蛙心心肌的收縮力及收縮頻率的變化情況，記錄蛙心心率和心力峰峰值(表示心肌收縮力的大小)。

1.7統計學方法 采用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1不同濃度的柴胡皂苷d對離體蛙心心率、心肌平均收縮力和心肌張力峰峰值的影響 終濃度為0.004 5、0.009 0、0.018 0 mmol/L的柴胡皂苷d對離體蛙心心率影響差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。在蛙心套管分別加入終濃度為0.004 5、0.009 0、0.018 0 mmol/L的柴胡皂苷d后，離體蛙心心肌平均收縮力逐漸上升，約在給藥后35 s時達到峰值，與給藥前比較，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，且隨柴胡皂苷d濃度的增加，柴胡皂苷d對蛙心心肌平均收縮力提高率〔(柴胡皂苷d灌流后35 s平均收縮力-給藥前平均收縮力)/給藥前平均收縮力×100%〕逐漸升高，具有明顯的藥物濃度依賴性；給藥35 s后離體蛙心心肌平均收縮力逐漸下降，約在5 min時低于其給藥前的心肌收縮力，但差異無統計學意義(P>0.05)，顯示柴胡皂苷d對離體蛙心心肌收縮力呈現出一個典型的先增強后減弱的作用。見表2。在蛙心套管中分別加入終濃度為0.004 5、0.009 0、0.018 0 mmol/L的柴胡皂苷d后，離體蛙心心力峰峰值逐漸上升，約在給藥后35 s時達到峰值，與給藥前比較，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；給藥35 s后，離體蛙心心力峰峰值逐漸下降，約在5 min時蛙心心力峰峰值顯著低于給藥前(P<0.05，P<0.01)，顯示柴胡皂苷d對離體對蛙心收縮力呈現出一個典型的先增強后減弱的作用；但隨著柴胡皂苷d濃度的增加，柴胡皂苷d對蛙心心力峰峰值提高率〔(柴胡皂苷d灌流后35 s時心力峰峰值-給藥前心力峰峰值)/給藥前心力峰峰值×100%〕逐漸升高，具有明顯的藥物濃度依賴性。見表3。

表1 不同濃度的柴胡皂苷d對離體蛙心心率的影響次/min)

1)給藥后35 s與給藥前比較，2)給藥后5 min與給藥前比較，表2、3同

表2 不同濃度的柴胡皂苷d對離體蛙心心肌平均收縮力的影響

表3 不同濃度的柴胡皂苷d對離體蛙心心力峰峰值的影響

2.2維拉帕米單用及其與柴胡皂苷d合用對離體蛙心心力峰峰值的影響 在蛙心套管中單獨加入終濃度為0.001 1 mmol/L維拉帕米后35 s和5 min時，離體蛙心心力峰峰值均下降，與給藥前差異有統計學意義(P<0.05)。在蛙心套管中同時加入濃度為0.001 1 mmol/L維拉帕米和終濃度為0.009 0 mmol/L的柴胡皂苷d后，離體蛙心心力峰峰值逐漸升高，約在給藥后35 s時達到峰值，與給藥前比較，差異有統計學意義(P<0.05)；給藥35 s后，離體蛙心心力峰峰值逐漸下降，約在5 min時，其心力峰峰值低于給藥前，差異有統計學意義(P<0.05)，離體蛙心收縮力呈現出一個典型的先增強后減弱作用。在給藥約35 s時，柴胡皂苷d和維拉帕米合用與單獨用維拉帕米，離體蛙心心力峰峰值的兩者比較差異有統計學意義(t=-5.794,P=0.001)。見表4。

表4 維拉帕米單用及其與柴胡皂苷合用對離體蛙心心力峰峰值的影響

1)給藥后35 s與給藥前比較，2)給藥后5 min與給藥前比較；與維拉帕米0.001 1 mmol/L比較：3)P<0.01

2.3艾司洛爾單用及其與柴胡皂苷d合用對離體蛙心心力峰峰值的影響 在蛙心套管中單獨加終濃度為0.040 6 mmol/L艾司洛爾后35 s和5 min時，離體蛙心心力峰峰值均下降，與給藥前差異有統計學意義(P<0.05)。在蛙心套管中同時加入濃度0.040 6 mmol/L艾司洛爾和終濃度0.009 0 mmol/L的柴胡皂苷d后，離體蛙心心力峰峰值逐漸升高，約在給藥后35 s達到峰值，與給藥前比較，差異有統計學意義(P<0.05)；給藥35 s后，離體蛙心心力峰峰值逐漸下降，約在5 min時，其心力峰峰值低于給藥前，但差異無統計學意義(P>0.05)，離體蛙心蛙心收縮力呈現出一個典型的先增強后減弱的作用。在給藥約35 s時，柴胡皂苷d和艾司洛爾合用與艾司洛爾單用比較，離體蛙心心力峰峰值比較差異有統計學意義(t=-4.234，P=0.005)。見表5。

表5 艾司洛爾單用及其與柴胡皂苷d合用對離體蛙心心力峰峰值影響

1)給藥后35 s與給藥前比較，2)給藥后5 min與給藥前比較；與艾司洛爾0.040 6 mmol/L比較：3)P<0.01

3 討 論

本實驗表明柴胡皂苷d對離體蛙心心肌收縮力具有增強的作用。維拉帕米和艾司洛爾分別為鈣通道阻滯劑和速效選擇性β1受體阻斷劑〔6，7〕，主要用于心絞痛、心律失常、高血壓等心血管疾病的治療〔8〕，艾司洛爾還可改善心肌損傷、抑制炎癥反應提高預后〔9〕。本研究中在蛙心套管中單獨加入維拉帕米和艾司洛爾時，兩者均使離體蛙心心力峰峰值下降；但當與柴胡皂苷d合用時，均使離體蛙心心肌收縮力增強。其原因是：單獨用時，維拉帕米是通過抑制心肌細胞外鈣離子的內流，降低胞內鈣離子的濃度，使心肌收縮力降低；艾司洛爾是通過減弱或取消兒茶酚胺對心臟的興奮作用，使心肌收縮力減弱〔6,7，10〕。當合用時，柴胡皂苷d通過激動離體蟾蜍心心肌的L型鈣通道和心肌細胞上的β1受體，并通過鳥苷酸結合蛋白-腺苷酸環化酶-環磷酸腺苷-蛋白激酶A通路，使心肌細胞內的cAMP水平升高、PKA活性增強，使心肌細胞膜中L型鈣通道磷酸化被激活，開放概率增加，進而使平臺期Ca2+內流增加，內流的Ca2+又激活連接肌質網膜中的雷諾丁受體，通過鈣觸發鈣釋放機制使胞質內鈣離子濃度進一步升高，引起正性變力作用〔11，12〕，從而使離體蛙心心肌收縮力增強。這說明對于加柴胡皂苷d 35 s后心肌收縮力下降的原因與相關報道一致〔13，14〕，可能與柴胡皂苷d體外誘導細胞膜通透性改變，從而導致細胞損傷或壞死、能量供應不足有關。細胞膜損傷、膜功能障礙時，Ca2+內流增多，大量鈣鹽沉積于線粒體，可造成呼吸鏈中斷，氧化磷酸化障礙〔15〕，最終導致ATP產生不足，使心肌收縮力降低。

綜上所述，柴胡皂苷d使離體蛙心收縮力的增強可能與柴胡皂苷d激動心肌細胞上的β受體進而激活L型鈣通道，促進鈣離子內流使胞質內Ca2+增加有關；使蛙心收縮力的減弱可能與細胞膜損傷、引起心肌ATP供能不足有關。