FOXC2對結腸癌細胞增殖、侵襲、遷移的影響及機制

張洋 張磊 吳慧麗 李琨琨

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院消化內科，河南 鄭州 450007)

結腸癌發病早期超過90%的患者可以通過手術治療治愈，但由于結腸癌早期臨床癥狀不明顯，大多數患者在確診時已經處于結腸癌的中晚期，耽誤了最佳的治療時機〔1〕。探討結腸癌的發病機制，尋找有效的靶基因治療結腸癌是目前研究的熱點。叉頭框(FOX)C2是一種轉錄因子，能夠調控小鼠胚胎發育和淋巴發育，在食管癌、大腸癌等中表達上調，并且與癌癥的預后、轉移等有關〔2～4〕。研究顯示，FOXC2在腫瘤細胞遷移、侵襲、上皮細胞間充質化(EMT)、血管生成等過程中均具有調控作用，是腫瘤發生和發展的重要調控基因〔5〕。本研究旨在探討FOXC2對結腸癌細胞生長、遷移和侵襲能力的影響，明確FOXC2在結腸癌轉移中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 結腸癌細胞SW620購于中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫；shRNA對照、FOXC2 shRNA為圣克魯斯生物技術產品；Lipofectamine 2000轉染試劑為美國 Invitrogen公司產品；FOXC2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物由上海生工合成；FOXC2一抗、鈣黏蛋白E(E-cadherin)一抗均為美國Abcam公司產品；基質金屬蛋白酶(MMP)-2一抗、MMP-9一抗均為美國Santa Cruz公司產品；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒、RNA提取試劑盒、蛋白提取試劑盒均購于美國Thermo。

1.2細胞培養 結腸癌細胞SW620從液氮中取出放在37℃融化后，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養液混合后，種植到細胞瓶中，放在37℃，5% CO2培養箱中培養。觀察細胞融合度達到90%時，加入0.25%的胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心10 min，棄酶消化液，加入細胞培養液重懸細胞，按照實驗要求不同比例接種到細胞瓶中繼續培養。

1.3細胞轉染 取培養至對數生長期的SW620細胞，胰蛋白酶消化細胞后，1 000 r/min離心10 min，加入細胞培養液懸浮細胞，種植到6孔細胞培養板中培養。倒置顯微鏡下觀察細胞融合度達到80%時，將FOXC2 shRNA和shRNA對照按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書轉染至SW620細胞中并依次命名為：FOXC2 shRNA組和shRNA-NC組，同時設置對照組，對照組細胞不予處理正常培養。培養48 h，Real time-PCR和Western印跡檢測細胞中FOXC2水平。

1.4Real time-PCR檢測E-cadherin水平 取1.3中對照組、shRNA-NC組、FOXC2 shRNA組細胞，加入胰蛋白酶消化后，提取細胞中的RNA，加入14 μl的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解后，紫外分光光度計檢測濃度和純度。取2 μg的RNA逆轉錄合成cDNA。Real time-PCR，以GAPDH為內參，2-△△Ct法分析FOXC2水平。FOXC2上游引物為5′-TTCAGAAGGTGGCTCAATGC-3′，下游引物5′-GGAGTGTTGGAGAAGTCATATTAC-3′。GAPDH上游引物為5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物5′-GGAGTGTTGGAGAAGTCATATAC-3′。實驗重復3次，取均值。

1.5Western印跡檢測FOXC2、MMP-2、MMP-9和E-cadherin蛋白水平 取1.3中對照組、shRNA-NC組、FOXC2 shRNA組細胞，提取細胞總蛋白，BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度。按照每孔40 μg蛋白樣品進行電泳，將蛋白與加樣緩沖液在振蕩器上混合后，放在100℃煮沸5 min，保存在4℃。用10%的分離膠和4%的濃縮膠進行電泳，在分離膠中的電壓為120 V，在濃縮膠中的電壓為80 V。半干法在4℃，0.8 mA/cm2把蛋白轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。取出PVDF膜，用5%的脫脂奶粉在室溫封閉1 h后，放在1∶800稀釋的一抗中4℃過夜反應，在1∶1 500稀釋的二抗中室溫反應1 h。顯色，曝光，以GAPDH為內參，分析蛋白水平。實驗重復3次，取均值。

1.6MTT檢測細胞增殖 對照組、shRNA-NC組、FOXC2 shRNA組細胞接種到96孔細胞培養板，細胞濃度為3×105個/ml，37℃，5% CO2培養48 h。每孔中加入50 μl的濃度為5 mg/ml噻唑藍(MTT)溶液，37℃靜置反應4 h。以不加細胞的孔為空白調零組。將培養液上清吸除后，每孔加150 μl的二甲基亞砜溶液，震蕩反應10 min，酶標儀檢測各孔A值，每組設置4個復孔。實驗重復3次，取均值。

1.7平板克隆檢測細胞克隆形成能力 對照組、shRNA-NC組、FOXC2 shRNA組細胞用胰蛋白酶消化后，種植到6孔細胞培養板中，每孔中加入200個細胞，培養14 d以后，用肉眼觀察細胞克隆數目。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，甲醇固定，吉姆薩染色后，計數細胞克隆形成數目，實驗重復3次，取均值。

1.8Transwell小室檢測遷移和侵襲能力 對照組、shRNA-NC組、FOXC2 shRNA組細胞經胰蛋白酶消化后，用不含血清的細胞培養液把細胞濃度調整為1×105個/ml。在實驗前3 h，取基質膠加入到Transwell小室中，放置于37℃環境中孵育濕化3 h，待基質膠凝固以后，在小室中加入不含有胎牛血清的細胞培養液繼續孵育40 min。取適量的細胞懸浮液加入Transwell小室中，放在24孔板中。小室外側加入細胞培養液。37℃孵育48 h后，用PBS洗滌Transwell小室，把沒有穿膜的細胞用棉簽擦掉，多聚甲醛固定，結晶紫染色，在顯微鏡下觀察侵襲細胞數目。細胞遷移能力檢測時Transwell小室不用基質膠包被，其他步驟同侵襲實驗。

1.9數據分析 采用SPSS22.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組FOXC2表達水平比較 shRNA-NC組細胞中FOXC2 mRNA和蛋白水平與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。FOXC2 shRNA組細胞FOXC2 mRNA和蛋白水平顯著低于對照組(P<0.05)。見圖1，表1。

1:對照組;2:shRNA-NC組;3:FOXC2 shRNA組圖1 Western印跡檢測轉染后細胞中FOXC2水平

組別mRNA蛋白對照組1.00±0.110.69±0.09shRNA-NC組1.01±0.080.68±0.06FOXC2 shRNA組0.47±0.091)0.14±0.031)

與對照組比較：1)P<0.05；表2同

2.2各組細胞增殖和克隆形成能力、遷移數目、侵襲數目及MMP-2、MMP-9及E-cadherin水平比較 shRNA-NC組細胞A值、克隆形成數目、遷移數目、侵襲數目及MMP-2、MMP-9和E-cadherin水平與對照相比差異無統計學意義(P>0.05)。FOXC2 shRNA組細胞A值和克隆形成數目、遷移數目、侵襲數目及MMP-2、MMP-9水平均顯著低于對照組，E-cadherin水平顯著高于對照組(P<0.05)。見圖2、表2。

1:對照組；2:shRNA-NC組；3：FOXC2 shRNA組圖2 Western印跡檢測 MMP-2、MMP-9和E-cadherin水平

組別A值克隆形成數目(個)遷移數目(個)侵襲數目(個)MMP-2MMP-9E-cadherin對照組0.75±0.0727.33±2.64186.75±16.97162.84±15.681.17±0.101.06±0.110.84±0.08shRNA-NC組0.76±0.0425.91±3.12188.26±17.34166.47±12.741.15±0.131.03±0.120.87±0.04FOXC2 shRNA組0.52±0.061)14.80±1.751)125.08±11.821)114.56±13.621)0.41±0.061)0.58±0.061)1.36±0.161)

3 討 論

FOXC2基因最初分離至小鼠腦組織中，因其含有FOX結構而命名〔6〕。人FOXC2基因定位在16q22～16q24，不含有內含子，只有一個單獨的外顯子，其編碼的蛋白質由494個氨基酸組成，含有一個forkhead結構，對于腫瘤的轉移具有促進作用〔7,8〕。FOXC2對腫瘤的作用機制與血管生成、血管生成因子、EMT等有關〔9〕。FOXC2在黑色素瘤中可以通過調控血管生成影響腫瘤的轉移過程，皮下注射黑色素瘤細胞后，FOXC2雜合突變的小鼠腫瘤血管生成能力低于野生型的小鼠，并且雜合突變小鼠MMP-2和MMP-9的水平也下降〔10〕。研究顯示，FOXC2能夠通過調控其他相關基因的表達和轉錄間接降低腫瘤細胞中E-cadherin的表達〔11〕。

FOXC2在卵巢癌、膠質瘤、宮頸癌、食管鱗癌等腫瘤組織中表達上調，并且與腫瘤的分期和轉移有關〔12～14〕。王靜苗等〔15〕研究表明，在70例結腸癌患者中有52例FOXC2表達陽性，而在30例癌旁組織中只有6例FOXC2表達陽性，并且其表達水平與結腸癌的淋巴結轉移、TNM分期及浸潤深度等有關。權原〔16〕研究表明，下調FOXC2對于卵巢癌細胞的侵襲、遷移具有抑制作用，并且對卵巢癌細胞的裸鼠成瘤能力也具有抑制作用。本研究結果顯示，下調FOXC2表達后的結腸癌細胞的生長和克隆形成能力下降，細胞的侵襲和遷移能力也下降，FOXC2下調后抑制結腸癌細胞生長、遷移和侵襲能力，這與上述實驗報道相符合，FOXC2在腫瘤轉移過程中可能發揮促進作用。

腫瘤的轉移過程較為復雜，癌細胞侵襲是發生癌癥轉移的前提條件，而隨著癌細胞侵襲的發生，癌細胞發生轉移〔17〕。癌細胞從原來的病發灶擴散進入到鄰近的正常組織器官中必須通過癌細胞的黏附作用才能實現，癌細胞到達血管內皮下基底膜，進入血液中，并且隨著血液的擴散達到其他組織中，在靶器官內皮細胞上黏附以后，克隆生長，形成轉移灶〔18〕。細胞的黏附作用有兩種：細胞與細胞之間的黏附和細胞與基質之間的黏附，E-cadherin是細胞間黏附作用的關鍵因子，屬于鈣依賴的跨膜糖蛋白〔19〕。研究顯示，E-cadherin在癌癥組織中低表達，E-cadherin水平還與癌癥的預后有關〔20〕。腫瘤細胞在侵襲和遷移發生時，需要通過MMPs降解相鄰的細胞外基質才能完成〔21〕。MMP-2、MMP-9在腫瘤細胞中表達上調，與腫瘤轉移呈正相關，是目前研究的與腫瘤轉移關系最為密切的MMPs家族成員。本研究結果顯示，FOXC2表達下調后的結腸癌細胞中MMP-2、MMP-9表達下降，而E-cadherin表達水平升高，說明FOXC2通過作用于MMP-2、MMP-9、E-cadherin影響結腸癌細胞的遷移和侵襲過程。

綜上，FOXC2表達下調抑制結腸癌細胞生長、遷移和侵襲能力，下調MMP-2、MMP-9蛋白水平，促進E-cadherin蛋白表達，FOXC2表達下調抑制結腸癌的轉移，對于其具體的作用機制仍然需要進一步探討。