腦缺血再灌注損傷分子生物學機制及現(xiàn)代中醫(yī)藥治療進展

雷夢南，李 玉，胡建鵬

（安徽中醫(yī)藥大學新安醫(yī)學教育部重點實驗室，合肥 230038）

腦血管病（CVD）泛指腦部血管的各種疾病，是當今世界三大疾病之一。缺血性腦血管病（ICVD）的死亡率在人類疾病中居第二位，約占80%～85%[1]。腦缺血一段時間后，血供功能不僅不能恢復，而且還會出現(xiàn)更嚴重的腦功能障礙現(xiàn)象，稱為腦缺血再灌注損 傷（cerebral ischemia-reperfusion injure, CIRI）。CIRI的病理生理過程屬于一個多因素參與、多環(huán)節(jié)循環(huán)、多途徑損傷的酶促級聯(lián)反應[2]。現(xiàn)今認為CIRI的發(fā)病機制主要與自由基損傷、興奮性氨基酸中毒、細胞Ca2+超載及凋亡等方面有關，且機制尚未明晰。筆者結(jié)合各種CIRI動物實驗基礎研究和CIRI相關現(xiàn)代中醫(yī)藥防治，為進一步探索CIRI的機制與治療提供了理論依據(jù)。

1 CIRI 分子生物學機制

1.1 自由基作用 CIRI產(chǎn)生的主要機制之一是自由基的作用[3]。自由基是廣泛存在于生物體內(nèi)的“活性氧成分”，主要包括非脂性自由基、脂性自由基、活性氧、其他脂質(zhì)過氧化物等[4]。大量過氧化物產(chǎn)生于腦缺血損傷形成過程中，其中可反映部分細胞損傷程度的是過氧化物MDA的過氧化水平[5]。在腦缺血組織中，大量自由基、活化氧被神經(jīng)元釋放。抗氧化酶類合成發(fā)生障礙無法清除過量的自由基，過多活性氧同樣不能被清除，自由基對腦組織的損傷逐步上升，主要變現(xiàn)為染色體畸變，核酸堿基改變或DNA斷裂。組織細胞中開始出現(xiàn)線粒體質(zhì)膜損傷，線粒體功能障礙進一步加重[5]，細胞氧化應激損傷隨之加重，一系列生物活性物質(zhì)被釋放造成腦組織細胞凋亡[6]。

1.2 興奮性氨基酸（excitatory amino acids, EAAs）毒性學說 EAAs是指具有2個羧基和1個氨基的酸性游離氨基酸，主要包括谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、乙酰膽堿及羧甲基-3-異丙烯基脯氨酸等[7]，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),在神經(jīng)元信息傳遞中發(fā)揮重要作用。生理狀態(tài)下，維持細胞正常生理活動運轉(zhuǎn)的是適量EAAs，而EAAs明顯增多在腦缺血形成過程里，EAAs受體的活化進一步增強[8]，過量的EAAs對神經(jīng)系統(tǒng)具有神經(jīng)毒性作用，是引起 CIRI 的重要途徑之一[9]。

1.3 細胞內(nèi) Ca2+超載 細胞內(nèi)Ca2+的集聚受鈣通道和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體在內(nèi)的異常活躍隔離系統(tǒng)的調(diào)控配置[10]。生理狀況下，細胞外Ca2+濃度高于細胞內(nèi)約萬倍，參與相關的神經(jīng)調(diào)節(jié)及傳遞。腦缺血時，由于Ca2+超載，蛋白激酶C被激活，加重了腦缺血缺氧的進程，影響DNA 裂解和軸突傳遞的進程，造成水腫和腦血管功能障礙等多方面的異常改變，從而導致腦細胞的不可逆死亡[11]。線粒體內(nèi)鈣超載誘導多種線粒體蛋白的去磷酸化，可抑制ATP合成；線粒體功能障及酶的活化作用及不可逆的神經(jīng)細胞損傷的出現(xiàn),是鈣超載影響 CIRI 的主要因素[12]。

1.4 血-腦脊液屏障（blood brain barrier, BBB）的破壞 位于腦室脈絡叢的上皮細胞、基底膜及星形膠質(zhì)細胞共同組成了血-腦脊液屏障，其中的腦毛細血管基底層主要由Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白等構(gòu)成，是維持BBB完整性的重要結(jié)構(gòu)基礎[14]；進而選擇性通透了腦組織液和腦脊液之間的物質(zhì)交換，腦內(nèi)外機制環(huán)境得以保持穩(wěn)定[13]。腦缺血再灌注后，大量的白細胞浸潤及蛋白水解酶的產(chǎn)生，損傷了微血管內(nèi)皮細胞的密切連接，升高基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，改變了BBB 通透性,致使腦缺血再灌注損傷的進一步加重[15]。同時，ATP的不足、細胞內(nèi)K+水平增加、乳酸酸中毒、細胞外谷氨酸的釋放等因素均使 BBB 的破壞加劇[16]。

1.5 神經(jīng)細胞凋亡 凋亡是CIRI神經(jīng)元損傷的形式之一，是體內(nèi)外因素觸發(fā)細胞內(nèi)預存的死亡程序受多種相關基因的影響而導致細胞死亡的復雜的病理生理過程，其具體的機制尚未完全清楚。資料表明細胞色素C、Bcl-2家族、P53蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶、組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶等相關調(diào)控基因與細胞凋亡關系最密切[17]。腦缺血發(fā)生時，由缺血所引起的Fas信號轉(zhuǎn)導通路的異常 、產(chǎn)生增多的Tat蛋白、EAAs 等使凋亡基因的表達升高，造成腦細胞的凋亡[18]。

2 CIRI現(xiàn)代中醫(yī)藥療法

2.1 中藥 近年研究顯示，多種中藥及其有效成分提取物對腦缺血再灌注損傷有保護機制，主要表現(xiàn)為減緩細胞膜損傷，降低Ca2+超載造成的細胞不可逆損傷、抑制白細胞的聚集、清除過量的自由基、抑制中性粒細胞與血管內(nèi)皮細胞的交互作用，影響基因表達與細胞凋亡調(diào)控等方面。

2.1.1 單味中藥及提取物 1）夏天無注射液（ICDP）。徐祖才等[19]應用TTC染色檢測大鼠腦組織梗死體積，免疫組化技術(shù)測定腦組織的磷酸化NF-κB表達水平。TTC檢測顯示，劑量不同的ICDP都可以降低相應組別大鼠的腦梗死的重量百分比；免疫組化染色顯示，磷酸化 NF-κB 主要集中表達在海馬區(qū)核中，而少量在CA3 區(qū)表達。結(jié)論： ICDP 能顯著降低缺血區(qū)腦損傷，顯著降低腦組織磷酸化NF-κB 蛋白表達，其機制可能與NF-κB 信號轉(zhuǎn)導通路的神經(jīng)保護作用及信號通路減弱有關。2）川芎嗪。李鵬飛等[20]采用改良Zea Longa栓線法構(gòu)建大腦中動脈梗塞模型，蘇木素伊紅（HE）染色檢查腦組織病理學改變，TTC染色法檢測大鼠腦梗死體積，實時定量PCR檢測大鼠梗死側(cè)腦皮層的Bcl-2、腫瘤壞死因子 、白細胞介素（IL）-1β的表達水平；免疫組化法驗證大鼠梗死側(cè)腦皮質(zhì)核轉(zhuǎn)錄因子及磷酸化NF-κB P65的表達。實驗表明：TMP治療可以改善大鼠神經(jīng)功能，使腦細胞含水量下降，顯著改善腦水腫、減少腦梗死面積以及改善腦部神經(jīng)組織的損傷，從而表明TMP具有一定保護腦神經(jīng)的機制，進一步抑制腦缺血的神經(jīng)細胞凋亡，降低再灌注所致腦組織結(jié)構(gòu)的損傷可能性。3）無患子皂苷。劉金林等[21]將大鼠隨機分組，采用線栓法復制腦缺血再灌注模型。結(jié)果顯示，無患子皂苷可降低炎性介質(zhì)血清TNF-α 含量、降低炎癥細胞的強烈趨化因子IL-1β 含量、降低腦組織細胞黏附因子 ICAM1 含量，來抑制腦缺血再灌注損傷過程中的炎癥反應，以減少腦組織的回流血量，從而減少腦內(nèi)組織自身炎性介質(zhì)的釋放，阻斷再灌注后炎癥級聯(lián)反應，改善缺血后繼發(fā)性腦損傷。

2.1.2 中藥有效成分 1）紅景天苷。王軍等[22]通過實驗來測定受試大鼠腦梗死體積，用PCR法檢測8-二氧基應激產(chǎn)物的表達水平，用定量RT-PCR測定提取mRNA進行反轉(zhuǎn)錄基因表達水平變化。紅景天苷具有清除自由基、保護受損的腦組織等功能[23]，實驗表明：紅景天苷可提高腦組織中的c-hif-1表達，對腦組織缺血再灌注損傷的抗損傷作用，減少再灌注所誘導氧化應激的發(fā)生[24]。2）葛根素。LIU等[25]將行中腦動脈閉塞（MCAO）法制備大鼠腦缺血模型，腦部梗死體積由TTC測定。研究表明，葛根素對大鼠缺血性腦損傷部分神經(jīng)元細胞有保護機制，可降低缺血性腦梗死體積，改善腦后神經(jīng)缺損缺血/再灌注，降低了白細胞介素-1β、白細胞介素- 6和腫瘤壞死Factor-α的表達，從而能有效促進大腦抵抗腦缺血再灌注損傷，并抑制炎癥反應。3）黃芪甲苷和三七。黃小平等[26]將大鼠隨機分組，采用RT-PCR方法測定葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋基因和腦組織蛋白質(zhì)表達。實驗結(jié)果表明，黃芪、三七活性成分能顯著改善腦缺血再灌注損傷后腦能量代謝，顯著提高缺血腦組織能量物質(zhì)利用率。經(jīng)配伍后，缺血后組織能量代謝有良好的調(diào)節(jié)作用。

2.1.3 中藥復方及中成藥 1）補陽還五湯。關莉等[27]實驗結(jié)果表明，補陽還五湯可預防大鼠腦缺血再灌注所致的GluR2表達下降，保護腦組織，從而抑制腦神經(jīng)元的凋亡。2）清熱化瘀Ⅱ號方。祝美珍等[28]經(jīng)研究表明，清熱化瘀Ⅱ號方可能通過減少TLR4-TRAM信號通路的傳導途徑，減少神經(jīng)元損傷，減少了其通路的表達，降低炎癥級聯(lián)現(xiàn)象。此外，還可保護大鼠腦缺血再灌注損傷的腦細胞[29]。

2.2 針灸治療 針灸可以減輕腦組織的抗氧化應激，使腦血管的舒縮功能得以緩解，使腦缺血再灌注后細胞壞死與凋亡得到抑制，改變了再灌注的BBB 結(jié)構(gòu)后，疏通腦缺血細胞的能量供應及代謝，保護再灌注后的腦組織。CHEN等[30]采用針刺百會和足三里穴位來檢測腦缺血再灌注大鼠的外周血清（miRNA124）和層黏連蛋白，整合素β1的水平。實驗結(jié)果表明：外周血中（miRNA124）顯著升高，且該作用隨時間的延長而更為明顯，層粘連蛋白的表達在缺血再灌注組要高于假手術(shù)組，整合素β1的水平在針灸組的表達要低于模型組。針刺百會和足三里可以緩解大鼠的腦缺血區(qū)域的細胞損傷，上調(diào)外周血清的（miRNA124）、層黏連蛋白及整合素β1的水平，其炎癥反應的介導得到緩解，進而發(fā)揮其在腦保護中的作用[31]。

3 小結(jié)

近年來，雖然CIRI的預防和治療得到了較大的改善，但目前來看，存在以下不足：1）有關腦缺血再灌注損傷的具體的分子生物學機制沒有得到一致的衡量標準，而實驗測量方法標準不一，實驗設計無創(chuàng)新性，而且關于腦缺血再灌注的模型制備沒有較為統(tǒng)一的標準；2）中藥復方的研究中，中醫(yī)藥特色配伍規(guī)律未展現(xiàn)，其配伍優(yōu)勢沒有得到良好發(fā)揮。

針對以上不足，建議：1）在基因分子視點上，深入探究CIRI分子生物學機制，采用標準統(tǒng)一的實驗測量方法，運用國際上較統(tǒng)一的實驗動物模型制備方法；2）在研究單味中藥及其有效成分的作用機制基礎上，需要加強研究中藥復方的主要成分間相互影響，從而使君、臣、佐、使在其得到充分的展現(xiàn)，以期在 CIRI分子生物學機制的深入研究及現(xiàn)代中醫(yī)藥預防治療方面細究具有重要的創(chuàng)新價值。