殺滅芽孢桿菌的方法及機理的研究綜述

劉仁杰,梁珊,李哲,樸春紅

(吉林農業大學 食品科學與工程學院，吉林 長春,130118)

芽孢桿菌是廣泛存在于植物中的一種內生菌。內生菌是指在整個生長周期中一直存在于植物的根、莖、葉和花朵等部位[1]，不會對宿主植物表現出任何外部病癥甚至對植物本身有益的菌株[2]。芽孢桿菌為好氧或兼性厭氧菌，易產生內生芽孢。芽孢壁厚而含水量低具有多層外壁，對光照、熱和輻射等都具有較強抵抗力[3]。芽孢桿菌菌體呈桿狀，大小為(0.3～2.2) μm×(2.1～7.0) μm，鞭毛典型側生，形成的內生孢子為抗熱型[4]。芽孢桿菌屬的建立是根據形態特征，即經典分類法確立，根據芽孢的形狀(卵型或球型)以及其在菌體或芽孢囊的位置，芽孢桿菌可分為3大類：群I，孢囊不顯著膨大，芽孢橢圓或柱形，中生到端生，革蘭氏陽性；群II，橢圓形芽孢，孢囊膨大，芽孢中生到端生，革蘭氏陽性、陰性或可變;群III，孢囊膨大;芽孢通常球形，端生到亞端生，革蘭氏陽性、陰性或可變[5]。常見的芽孢桿菌有蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌和產氣芽孢桿菌等。枯草芽孢桿菌與蠟樣芽孢桿菌存在于空氣、土壤中，極易于食品接觸。對于大豆作物而言，枯草芽孢桿菌是一種植物內生菌，與食品的加工、生產及儲存過程密不可分，難以避免。而其他令我們聞而色變的芽孢桿菌如昆蟲病原菌蘇云金桿菌(B.thuringiensis)，人畜病原菌炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)、蕈狀芽孢桿菌(B.mycoides)、韋氏芽孢桿菌(B.weihenstephanensis)，也廣泛存在于外部環境中[6]。

芽孢桿菌可以產生內孢子，對不利環境有較強抵抗力，可能在多種食品保質期內萌發，引起食品腐敗變質和疾病的傳播。蠟樣芽孢桿菌在意外攝入量>103CFU/g時，1～6 h內可以引起嘔吐、腹瀉；在8～16 h可在小腸內形成熱不穩定性腸毒素，導致嚴重腹痛及水樣腹瀉[7]。近幾年，蠟狀芽孢桿菌開始作為益生素加入到食品和飼料中，作為一種有益微生物促進植物生長、防治病蟲害[8]，但對這些菌株進行安全性評價是非常必要的。產氣莢膜梭狀芽孢桿菌可以引起人和動物組織毒性和胃腸道疾病，起病急、病程發展迅速，作用于空腸及回腸，以腹痛、腹瀉、腹脹、便血、嘔吐、發熱為主要中毒癥狀[9],這與金黃色葡萄球菌中毒癥狀相似，不利于病癥的診治[10]，引起腸道病理性病變及壞死[11-12]，嚴重時會導致消費者急性中毒死亡[13]，且常規抑菌劑如乳酸鏈球菌素、山梨酸鹽、苯甲酸及殼聚糖等抑制作用不明顯。枯草芽孢桿菌雖然不會對人體產生嚴重的毒害作用，但是其迅速繁殖會產生感官上的不良感受。

芽孢可以存活于經過巴氏殺菌的嬰兒配方乳粉中，在經過沖泡后，室溫條件下放置8 h，即可以產生105CFU/g的病原菌，嚴重危害嬰幼兒的健康，降低嬰幼兒食品安全性[14]。中溫好氧芽孢桿菌廣泛存在于原料奶中，在經過超高壓瞬時殺菌后仍然可以在牛奶中生長萌發，菌落數可較快達到105CFU/mL，嚴重影響奶制品的品質并縮短其貨架期，成為奶制品行業的一大難題[15]。在乳品工業中，發現一些耐低溫的蠟狀芽孢桿菌和韋氏芽孢桿菌，在6 ℃甚至是更低的條件下繁殖，并產生腸毒素引起食物中毒[16]。芽孢可在一切適宜條件下生長，并快速繁殖，嚴重影響食品安全。目前芽孢桿菌被許多國家認定為一種最常檢出的微生物，成為食品檢測的必檢項目。本文就芽孢桿菌的殺滅方法和殺滅機理進行綜述。

1 芽孢桿菌的殺菌方法研究進展

1.1 熱殺菌法

熱殺菌法主要包括巴氏殺菌法、超高溫瞬時殺菌和高壓滅菌法等。熱殺菌技術在食品工業中應用廣泛，熱殺菌的本質是用燃料或電阻加熱在食品外部加以熱能，將熱能轉移到食品內部，從而達到殺菌和鈍化酶的目的[17]。但熱殺菌過程中高溫會導致食品色澤、風味的改變和營養物質的損失。對于芽孢桿菌來說，孢外壁、芽孢衣和皮層共同組成的細胞外壁厚且結構豐富，常規熱傳遞難以作用于核心部位，達不到有效殺滅的目的[18]，常與其他殺菌方法混合使用增強殺菌效果。高溫殺菌會使食品的口感、色、香、味以及營養成分發生嚴重劣變，降低商業價值。對于熱能的消耗也嚴重增加了產品的生產成本，因此熱殺菌法越來越不受消費者和生產者的歡迎。

1.2 高壓殺菌法

高壓殺菌法有高靜壓法和高壓脈沖電場法。高靜壓殺菌技術是將100～1 000 MPa的靜態液體壓力施加于食品上并保持幾秒鐘到幾十分鐘，起到殺菌、破壞酶及改善物料結構和特性的作用[19]。黃訓端等[20]發現蠟樣芽孢桿菌(1010CFU/mL)在室溫下施壓15 min，壓力越大對芽孢桿菌的損傷程度越大，死亡率越高。脈沖電場殺菌技術是將高電壓(15～100 kV/cm)脈沖作用于電極間的食品，常溫下進行，作用時間極短，一般<1 s。高壓殺菌技術對于一些對壓力抵抗力較弱的芽孢桿菌極富效果，對某些頑強的芽孢需要更大壓力。超高壓設備體積大而昂貴，小型生產企業難以應用，導致超高壓殺菌法無法廣泛應用。

1.3 氣體殺菌法

氣體殺菌法主要包括臭氧殺菌法和二氧化氯殺菌法等。臭氧具有廣譜抗菌特性，對細菌營養細胞、芽孢、病毒、真菌均有高效殺滅作用。2001年FDA將臭氧列入可直接與食品接觸的添加劑范圍[21]。耿淑潔等[22]發現臭氧對枯草芽孢桿菌芽孢有較強的滅活作用。在pH為8.16、水溫為(20±1)℃條件下，7個對數級芽孢經臭氧作用5 min后，失活4.68個對數級，可控制絕大多數芽孢桿菌的活性，但對于生長繁殖極其迅速的芽孢桿菌來說，殺滅不徹底就意味著芽孢桿菌仍對食品存在巨大威脅。2013年白小龍[23]發現在二氧化氯氣體質量濃度為100 mg/L、殺菌40 min，二氧化氯氣體對苦蕎表面的枯草芽孢桿菌具有良好殺滅效果。但氣體殺菌法對于結構致密的物質而言，難以達到其內部，僅能殺滅物質表面的芽孢桿菌，不能對內部芽孢桿菌進行良好的抑制。

1.4 化學滅菌法

化學滅菌法包括添加抑菌劑和添加消毒劑。常用的抑菌劑包括山梨酸鉀、苯甲酸鈉、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、乳酸鈉、乳酸鏈球菌素等。AOUADHI等發現山梨酸鉀和乳酸鏈球菌素聯合作用，在24 h內可以緩慢抑制LTIS27型芽孢桿菌的萌發和生長，在5 d后可以達到完全抑制的作用。現階段人們更加趨向于對天然抑菌劑的研究,如丁香酚[24]、肉桂醛[25]、大蒜素[26]和魚腥草[27]等物質，雖然這些物質可以對芽孢桿菌起到一定抑制作用，但不能完全抑制或者及時殺滅。還有其他化學物質如乙醇、乙酸等，這些物質的添加會導致食品色澤風味的改變，令消費者難以接受，且作用效果不顯著。現今對于食品安全的重視導致化學物質的加入,增加了消費者購買的心理顧慮，越來越多的人拒絕添加劑的濫用。

1.5 促萌發法

由于芽孢桿菌的特殊生理結構，常規有害微生物的防治方法并不適用于芽孢桿菌的滅活，技術上存在一定的壁壘，消費者心理也難以承受。近年來對于促萌發法的研究引起了人們的廣泛關注，其優點在于添加的物質成分簡單易于接受，作用較為迅速。孢子的萌發是芽孢桿菌生長繁殖的第一步，此時萌發形成的營養細胞對于外界環境失去抗性，簡單方法即可完全殺滅。

這種方法主要分為兩種方式，一種采用營養物質如葡萄糖、果糖、L-丙氨酸和D-丙氨酸等，另一種是用非營養物質如Ca+-DPA和十二烷烴等誘導內生芽孢萌發，產生營養細胞用較低溫度(65 ℃, 30 min)即可將芽孢桿菌殺滅的方法。TEHRI等[28]用糖類和氨基酸對巨大芽孢桿菌MTCC2949誘導萌發，用吸光度、熒光染色和酯酶測定萌發效果，發現L-丙氨酸可以有效誘導芽孢桿菌孢子萌發。AOUADHI等[29]在2013年將D-葡萄糖(1 mmol/L)和L-丙氨酸(100 mmol/L)混合使得LTIS27芽孢桿菌萌發89%。通過對于不同種類以及不同基因型芽孢桿菌的研究發現：不同芽孢桿菌需要不同的促萌發劑，篩選出一種廣譜高效的促萌發劑至關重要。不同促萌發劑的混合使用可以增加芽孢桿菌的萌發率，目前對于營養物質混合添加是增加促萌發率行之有效的辦法之一。

2 芽孢桿菌的殺菌機理研究進展

2.1 核蛋白以及酶對芽孢桿菌的影響

常規熱殺菌的殺菌機理就是通過熱傳遞與熱傳導將熱能轉移到芽孢內層核心部位，使芽孢質和芽孢核中的酶等蛋白變質，蛋白質的變質會導致細胞無法增殖分化，從基因層面以及生長環境方面抑制芽孢桿菌的活性，達到滅活的目的。

高壓殺菌法的殺菌機理是使芽孢桿菌中的氫鍵、離子鍵和疏水鍵等非共價鍵發生改變，破壞蛋白質和酶的穩定性，從而殺滅芽孢桿菌。HO等[30]用高壓脈沖電場(HPEF)處理水溶液中幾種酶，發現HPEF對葡萄糖氧化酶，脂肪酶，α-淀粉酶鈍化率都達到了75%以上，而α-淀粉酶鈍化率更是達到了85%。過氧化物酶鈍化率30%，多酚氧化酶鈍化率40%，堿性磷酸酶的鈍化率只有5%。可以發現高壓也是作用于細胞的酶，達到殺菌的作用。100～200 MPa下可以使芽孢桿菌的受體蛋白被激活，而更高壓力(500～600 MPa)下可以導致Ca2+-DPA通道打開，引起孢子的萌發。

臭氧殺菌作用機理是先作用于細胞膜，使膜構成成分受損傷而導致新陳代謝障礙，臭氧繼續滲透穿過膜而破壞膜內脂蛋白和脂多糖，改變細胞的通透性，導致細胞溶解、死亡；同時臭氧還能使細胞活動所必要的酶失去活性，而影響其正常的生理功能。臭氧作用方式有兩種：I.臭氧溶于水直接反應；II.臭氧分解生成的羥基間接反應。一般情況下由兩種方式同時發揮作用，作用效果更強[31]。CO2與高壓同時作用使芽孢桿菌機械性損傷，導致細胞核內容物外泄，嚴重破壞其生理結構[32]。

霍健聰等[33]將魚腥草提取物作用于枯草芽孢桿菌的細胞壁，造成細胞壁破裂，內容物泄漏，最終導致菌體崩解、死亡。與丁香酚、檸檬醛等作用機制相似，都是作用于芽孢桿菌細胞壁，最終發揮抑菌效果。王曉英[34]發現蒲公英總黃酮類提取物可以妨礙芽孢桿菌蛋白質的正常表達，導致芽孢桿菌正常生理功能喪失，起到抑菌作用。王濤[35]在2011年發現嗜熱脂肪芽孢桿菌通過抑制劑的作用可導致細胞耐熱性明顯降低，進而破壞細胞結構，引起細胞凋亡。

2.2 膜受體以及通道對于芽孢桿菌的影響

促萌發方法的殺菌機理：營養物質誘導的萌發是由于芽孢桿菌表面的營養受體引起的，研究表明只有外界化學物質與其特定的受體蛋白結合，才能傳導萌發信號。現發現營養受體上有3種操縱子gerA、gerB和gerK，gerA操縱子是芽孢桿菌孢子萌發的主要操縱子[36-37]，gerA上含有gerAA、gerAB和gerAC三種同源編碼蛋白[38]。萌發的孢子中至少含有其中一種操縱子才能行使萌發功能。萌發劑與受體之間并不是一一對應的關系，有時一種促萌劑需要多種受體同時發揮作用，如gerA是L-丙氨酸的受體蛋白[39]，gerB和gerK是葡萄糖的萌發受體[40]。營養物質對不同基因型的芽孢桿菌是否起萌發作用也要歸因于萌發受體的識別作用。這些操縱子向核蛋白傳遞信號，啟動萌發程序，在十幾分鐘甚至幾分鐘就可以完成萌發指令。另外有研究表明營養物質進入芽孢桿菌的內部過程需要經過孢子衣與皮層，而芽孢桿菌中的另一種蛋白gerP是參與編碼芽孢桿菌外壁的主要蛋白，對芽孢桿菌的殺滅同樣起重要作用[41]。

非營養物質誘導的萌發可能是由于離子通道受阻引起的，其中離子通道主要包括：鉀離子通道、鈣離子通道、鈉離子通道等。不同物質抑制芽孢桿菌孢子萌發的離子通道是不同的[42]。芽孢桿菌萌發會導致細胞透過性增強，導致細胞核中的氫離子、鉀離子和鈉離子外泄，同時伴隨著鈣離子的釋放。JOHNSON[43]發現枯草芽孢桿菌中YlaJ和YhcN蛋白的缺失會降低孢子的萌發速率，可能是YlaJ和YhcN蛋白參與編碼SleB和cwlJ皮質水解酶，其中SleB皮質水解酶發揮主要作用。皮質水解酶會分解芽孢壁，導致芽孢萌發速率的改變。在蠟樣芽孢桿菌中發現一種受體蛋白gerN，與次黃嘌呤核苷酸誘導的萌發密切相關[44]。次黃嘌呤核苷酸對于離子變化極其敏感，因此推斷gerN可能參與編碼細胞內的離子通道。

兩種殺菌機理相輔相成，細胞膜的皮質水解酶中的肽聚糖受損，易導致外來物質(營養物質以及非營養物質)的進入，同時也導致細胞核內的陽離子外流，增加了細胞膜的流動性，影響離子通道的開放。微觀層面上是由于細胞膜表面上的蛋白受體，受操縱子的影響反作用于細胞核刺激釋放出萌發信號。同時細胞中的胞內酶與胞外酶受蛋白質的影響，溶解芽孢桿菌外層堅韌結構，使芽孢桿菌對外界環境抗性降低，最終引起細胞的滅活。

3 結論與展望

隨著人民生活水平的提高，消費者對于食品安全格外看重。芽孢桿菌不易被完全殺滅，在食品中萌發會降低食品保質期，危害消費者健康。因此對芽孢桿菌殺滅技術的研究是不可或缺的，有效地保證食品安全，提高人民對于芽孢桿菌的重視至關重要。目前對于芽孢桿菌的殺滅仍存在如下問題：(1)芽孢的多層結構在整個生長周期中，分別起到何種作用以及作用機理尚不明確。(2)目前對于芽孢桿菌的研究逐年增多，但僅限于對單種芽孢桿菌的殺滅研究，實際生產中常出現兩種甚至多種芽孢桿菌同時存在的情況，多種芽孢桿菌間的協同或拮抗作用對于芽孢桿菌殺滅的影響尚未明確。(3)添加有益菌防治有害菌仍是目前許多致病菌的有效防治手段，但篩選對芽孢桿菌有殺滅作用的益生菌的研究寥寥無幾，對于其中有效成分的提取及分析更是未見涉及。(4)近幾年，一些芽孢桿菌開始作為益生素加入到食品和飼料中，作為有益微生物促進植物生長、防治病蟲害。但對于這些菌株的安全性評價尚未作出明確的認定。

芽孢桿菌的防控已經越來越受廣大研究者的重視，目前研究主要針對芽孢桿菌的殺滅方法，對于芽孢桿菌的殺滅機理的研究仍然缺乏，應該加大這方面的研究力度。探索不同基因型芽孢桿菌之間的共性，可為有效殺滅芽孢桿菌提供理論依據。同時，應考慮消費者對添加物的接受度，對其安全性和有效性進行系統的研究。還可以將抑菌劑與萌發劑進行整合，開發復合防控手段，為食品生產企業提供高效的技術支撐。