FTIR 顯微紅外光譜結合化學計量學在燒死鑒定中的研究

張 忠，薄彥樂，羅儀文，林漢成，王 磊，黃 平，李周儒，陳麗琴

（1.內蒙古醫科大學 法醫學教研室，內蒙古 呼和浩特 010030；2.司法鑒定科學研究院 上海市法醫學重點實驗室上海市司法鑒定專業技術服務平臺，上海 200063；3.寶雞市扶風縣公安局 刑事科學技術室，陜西 寶雞 722200；4.徐州醫科大學 法醫學教研室，江蘇 徐州 221004）

在法醫學實踐中，面對火場中發現的尸體，快速準確的判斷燒死還是死后焚尸，可為明確死因，判斷火場性質提供重要信息[1]。 通常，法醫根據尸表特征檢驗、呼吸道和消化道有無炭末沉積以及心血中碳氧血紅蛋白含量檢測等方法鑒別燒死和死后焚尸[2-3]。 然而，這些方法或依靠主觀經驗或受限于火場情況，很難客觀準確地鑒別燒死和死后焚尸[4]。近來，有學者利用尸體征象和免疫組織化學等方法探究燒死尸體的特征變化，包括分析舌尖與牙齒的位置關系，皮膚水通道蛋白3 等表達[5-6]。但據報道，舌尖位置與燒死的關系還需要進一步的研究證實[7]。 而免疫組織化學方法需要昂貴的實驗試劑和復雜的實驗流程，限制了其在法醫學實踐中的應用。 因此，燒死的法醫學鑒定和研究仍需一種更加簡便、可靠的實驗手段。

構成機體組織和細胞的基本物質是蛋白質、糖、脂肪和核酸等。 外界環境作用于機體主要引起相應生物分子含量、結構以及化學基團的變化。 燒死通常會使受害者吸入火場中燃燒所產生的高溫煙霧，對肺支氣管上皮組織和細胞產生直接或間接的影響[8]。 傅里葉變換紅外（fourier transform infrared reflection，FTIR）光譜技術是研究生物組織和細胞分子結構和化學基團的有效手段，具有靈敏度高、分析速度快、無損檢測等優點[9]，被廣泛地應用于生物醫學、食品工業、藥品檢測等多個領域[10-12]。 化學計量學方法是基于統計學、計算機科學等學科的方法和原理，挖掘與處理數據信息，獲取復雜分析體系中的有用信息[13]。 紅外光譜結合化學計量學方法能最大限度地提取光譜信息，具有分析效率高，分析結果的重復性和再現性優于常規分析方法等特點。目前，該方法已成功地應用于法醫學領域，如血痕形成時間推斷、血痕種屬鑒別、復雜性死因鑒定以及皮膚電損傷鑒定等[14-18]。 因此，本研究運用FTIR技術結合化學計量學原理算法對燒死和非燒死肺組織支氣管上皮進行分析，旨在為燒死法醫學鑒定和研究提供新的輔助性手段。

1 材料與方法

1.1 樣本收集和準備

收集10 例燒死尸體肺組織，其中男性7 例，女性3 例，平均年齡39.5 歲；20 例非燒死案例肺組織，其中男性11 例，女性9 例，平均年齡41.8 歲，死因包括心血管疾病、顱腦損傷、失血性休克。 以上案例來源于司法鑒定科學研究院及內蒙古醫科大學法醫學教研室。 每例肺組織在左右肺上下葉至少取材4 塊，大小為10 mm×10 mm×3 mm。 經4%甲醛固定后常規制作蠟塊。 對于肺組織樣本，行連續切片，一張厚度4 μm，鋪于普通玻璃載玻片上，另一張厚10 μm，鋪于氟化鋇載玻片上。 所有切片常規方法脫蠟。 將普通玻璃載玻片上的組織行常規HE 染色。 氟化鋇載玻片上的組織無需染色，直接進行光譜掃描。

1.2 光譜的采集和預處理

應用傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet6700，Thermo Fisher Scientific，美國）、紅外顯微鏡（Niclot continuum microscope, Thermo Fisher Scientific，美國）及其配備工作站OMNIC 8.0 采集肺組織支氣管上皮細胞區域的紅外光譜。 掃描條件：透射模式，經液氮冷卻，室溫，掃描范圍為4 000～900 cm-1，光柵直徑50×50 μm2，掃描次數為32 次，分辨率為8 cm-1。 每個樣本檢測前在氟化鋇載玻片的空白區域進行背景掃描。 燒死組，先在肺組織HE 染色切片上確定肺支氣管上皮區域，然后于氟化鋇載玻片組織對應區域采集外光譜；對照組，直接收集肺支氣管上皮紅外光譜。 應用Matlab R2016a（MathWork，美國）軟件進行數據預處理。 光譜使用9 點SG 平滑轉化為二階導數變換，然后進行多元散射校正消除因組織厚度不均導致光譜差異的影響，增強與成分含量相關的光譜信息。 在本研究中，選取1 800～1000cm-1的生物指紋區光譜。包括酰胺Ⅰ帶（1600～1690cm-1），酰胺Ⅱ和Ⅲ帶蛋白質（1480～1575cm-1,1229～1 301 cm-1）[19]。

1.3 數據分析

數據采用PLS Toolbox8.5.2 的Matlab R2016a軟件進行主成分分析（principal component analysis,PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares for discriminant analysis，PLS—DA）。

2 結果

顯微鏡檢查結果：與對照組相比，燒死組肺臟組織支氣管黏膜上皮杯狀細胞增多，黏液分泌增加，支氣管黏膜充血，細胞核固定呈柵欄狀排列（圖1）。

圖1 支氣管黏膜上皮組織（HE×40，標尺長度：25 μm）

比較燒死組與對照組平均光譜，與對照組相比，燒死組酰胺Ⅰ帶寬度增加且吸收峰高度較低（圖2A）。 燒死組和對照組光譜數據經二階導數變換處理后，酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶呈現多個蛋白質二級結構吸收峰。 對照組支氣管上皮的光譜特征在1 651cm-1和1 547cm-1附近， 而燒死組支氣管上皮的光譜特征是在1 689cm-1和1 624cm-1附近。（圖2B）。

圖2 燒死組與對照組平均光譜和二階導數變換后吸光度的比較

為進一步觀察蛋白質二級結構的變化，對二階導數光譜進行PCA 分析。 圖3 為PC1 和PC2 得分散點圖，圖中橫坐標表示每個樣本第一主成分得分值， 縱坐標表示每個樣本的第二主成分得分值，前兩個主成分的累計可信度已達78.84 %。 PC1、PC2的得分散點圖顯示，燒死組分布在y 軸的左側，對照組分布在y 軸右側，且兩組樣本間沒有出現重疊。 此外，從樣本分布的疏密程度來看，對照組樣本分布相對集中，燒死組樣本更加分散（圖3A）。 PC1 的載荷因子圖顯示， 沿著PC1 1 624 cm-1和1 689 cm-1對燒死組光譜貢獻比較大，在1 651 cm-1和1 547 cm-1對于對照組貢獻比較大（圖3B）。

十折交叉驗證結果顯示，當潛變量為3 的時候，交互驗證的校正標準偏差值最小，確定最佳潛變量數為3（圖4A）。使用3 個潛變量用于建立初始PLS 模型。 PLS-DA 內部交叉驗證對燒死組預測結果顯示，燒死組樣本分布在預測值1 周圍，對照組樣本分布在0 周圍，并且燒死組樣本全本分布在紅色分界線以上，分類準確率為100 %（圖4B）。

圖3 PCA 結果

圖4 交叉驗證結果

3 討論

燒死是法醫鑒定工作中較為常見的一種死因，然而，受火災現場的復雜性和破壞性以及其他因素影響，常規輔助檢查方法受到限制，為法醫工作者帶來了巨大挑戰。 因此，燒死尸體的鑒定和研究仍需一種更加簡便、可靠的手段。 致死性燒傷支氣管皮上皮可表現出生活反應，如熱呼吸道綜合癥，顯示呼吸道黏膜凝固性壞死，細胞核變長呈柵欄狀排列等。 可見圖像提供關于細胞形態學變化的信息，但沒有分子信息。 而FTIR 顯微光譜技術可以精確檢測生物組織中的化學組分及分子結構，并且操作簡單，檢測效率高，已被廣泛地應用于生物醫學、食品工業、藥品檢測等多個領域。 本研究的目的是利用FTIR 技術結合化學計量學方法，對燒死與非燒死尸體肺組織特征光譜進行比較分析，力圖尋找一種新的方法，為燒死和死后焚尸的法醫學鑒定提供科學支持。

本研究選取光譜指紋區波段1 800～1 000 cm-1進行數據分析。 酰胺Ⅰ帶為最常用的蛋白質分析帶，一般在1 650 cm-1附近，幾乎完全由肽腱的C=O伸縮振動產生。 酰胺I 帶的吸收光譜通常是相同的，并且對蛋白質構象的改變特別敏感[20]。本實驗中燒死組和對照組平均光譜在酰胺Ⅰ帶峰形具有明顯差異，峰高偏差和變形表明蛋白質結構發生明顯變化，這可能是由于熱作用導致的支氣管上皮細胞蛋白變性[21-22]。二階導數變換是解決譜帶重疊的常用方法，其中負峰直接與非衍生譜的中心峰對齊[23]。 二階導數變換后燒死組在酰胺I 帶附近出現1 624、1 659、1 689 cm-1三個特征性吸收峰，三個特征峰所對應的蛋白質二級結構分別為β-折疊、α-螺旋、β-轉角，在酰胺II 帶附近出現1 547cm-1對應的蛋白質二級結構為α-螺旋[24]。說明了燒死肺組織確實存在客觀的改變。 有研究利用紅外光纖傳感器探測熱變性過程中牛血清白蛋白的二級結構，發現變化主要是隨著溫度升高α-螺旋逐漸減少，β-轉角和β-折疊增多[25]。

PCA 是一種無監督的統計方法，經常被用來分析數據集之間的差異和相似性，能夠將高維度數據轉換為低維，同時保留最重要的分類信息，分類結果通過樣本在一組正交的主成分上投影來表示[26]。本實驗PCA 結果顯示，燒死組和對照組樣本點沿著PC1 完全分開，PC1 占總變異的71.94 %，可表征大部分的數據特征。 從樣本分布的疏密程度來看，對照組樣本分布相對集中，表明所有正常組織的化學成分更加相似，而燒死組樣本光譜分布更加分散，表明燒死組樣本支氣管上皮組織差異較大，原因可能是支氣管黏膜所受的損傷程度不同。 與主成分相關聯的載荷因子反映變量對PCA 的貢獻度[27]。 PC1的載荷因子1 624 cm-1（β-折疊）和1 689 cm-1（β-轉角）對PCA 貢獻較高，且燒死組呈正相關；1 651cm-1和1 547 cm-1（α-螺旋）同樣對PCA 有較高貢獻度，但是與對照組呈正相關，而與燒死組呈負相關。 這表明燒死和非燒死組樣本中的蛋白質二級結構含量存在顯著差異， 這是光譜數據分類的客觀依據。這些蛋白質二級結構的變化可能與焦耳熱引起的蛋白質變性有關，隨著溫度升高α-螺旋逐漸減少，β-轉角和β-折疊增多[28]。 本研究展示了FTIR 光譜結合化學計量學識別致死性燒傷支氣管上皮蛋白質結構變化的能力，進一步反映了其對燒死支氣管上皮細微分子變化的高敏感性。

PLS-DA 是一種具有偏最小二乘回歸性質的有監督分類技術，是有效的多元分類手段，以一組測量數據為基礎，利用偏最小二乘回歸的預測值來實現分類[29]。 利用PLS-DA 對燒死組和對照組63 條訓練集樣本光譜進行判別分析。 在模型建立前，關鍵的一步是潛變量的選取，潛變量是原始變量的線性組合，可以用來描述一組解釋變量（即，光譜數據的矩陣）。潛變量若選擇過少模型會出現欠擬合，選擇太多會引入噪聲，模型會出現過擬合[30]。 通常采用交叉驗證進行潛變量數的選取[31]。因此，本研究應用10 個交叉驗證組執行交叉驗證，最終選取3 個潛變量用來建立PLS-DA 預測模型。 本實驗中燒死組和對照組樣本被準確的識別，模型分類準確率達到100%。評價判別模型的最好方法是對模型進行外部驗證，但由于實踐中樣本量不足，本實驗只選用內部交叉驗證的方法來驗證模型性能。 所以，下一步研究需要收集更多的樣本，提高該模型的預測能力。

綜上所述，本研究初步探討了燒死和非燒死尸體支氣管上皮組織的光譜學變化，并通過PCA 分析了燒死組與對照組之間的差異，建立了PLS-DA 判別模型，對燒死樣本進行分類，為下一步模型參數的優化以及燒死樣本的預測奠定了基礎，為燒死案件的法醫學鑒定提供科學依據，也為其他死因的法醫學研究提供了參考。