轉基因大豆水酶法制油過程中內、外源基因的分布研究

張曉旭，陳復生，張麗芬，辛穎

（河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州450001）

大豆是我國的七大糧食作物之一[1]，也是世界上主要的油料作物之一，含有40%左右蛋白質，20%左右脂肪，其種植廣泛，以美國的大豆產量列居全球之最[2]。近5年來，我國大豆的年產量在1 200萬噸左右，但是年消費量達到了10 000萬噸左右，對外依存度已高達80%左右，這些進口大豆多為美國、巴西和阿根廷的轉基因大豆。

大豆油是轉基因大豆的主要消費途徑之一，壓榨法、有機溶劑浸出法和水酶法是常用的提油方法，我國95%以上的大豆油都是使用有機溶劑浸出法提取[3]，最常見的有機溶劑是己烷，由于己烷在大豆油和空氣中的殘留會對人體及環境造成危害[4]，研究者開始探索高出油率的替代工藝，在眾多潛在替代方案中，水酶法[5-6]已經得到了普遍關注。水酶法是在破碎大豆細胞壁的基礎上，以水為介質，對脂蛋白、脂多糖進行降解，使油脂釋放出來，其條件溫和、工藝簡單、耗能低，在無污染的前提下，可以同時提取油和蛋白質[7]。為了更大限度的提高大豆出油率，國內外學者對大豆的預處理方法進行了研究，發現擠壓膨化預處理方式展現了明顯的優勢，大豆經擠壓膨化后脂肪聚集并且充分暴露在表面[8-9]，蛋白質結構也由有序轉變為無序，增加了蛋白對酶攻擊的敏感性[10-11]，同時，減少了酶解后油與蛋白形成的乳狀物[12-14]。

目前，關于轉基因食品的安全性眾說紛紜，人們依賴轉基因大豆帶來的益處的同時，也在嘗試各種辦法以最大限度的降解轉基因大豆的外源基因，以降低轉基因食品對人體的影響。王衛國等[15]探究微波處理和超高壓處理對轉基因大豆外源基因降解的影響，發現與超高壓處理相比，微波處理對轉基因大豆外源基因的降解更加明顯。國內外對轉基因食品的研究主要集中在轉基因成分的檢測及其食用或飼用安全性上[16-18]，而對轉基因大豆制油過程中內、外源基因的降解狀況鮮有報道。本課題通過數字PCR技術，探索經過擠壓膨化后的轉基因大豆提油過程中內、外源基因的降解變化規律，為我國轉基因生物標識制度的監管提供有力的技術支持，同時，也為水酶法提取轉基因大豆油安全性評價提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉基因大豆：河南神農膨化飼料科技有限公司。

濃鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、異丙醇、氯仿、異戊醇、0.5 mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：均為分析純，購自上海生工生物工程股份有限公司；堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L（2.4 AU/mL）：青島吉寶中新國際貿易有限公司；RNA酶（Cat.#：2158）、Mix（RR901A）：寶生物工程（大連）有限公司；Tris-HCl：天根生化科技有限公司；十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：河南工業大學糧油食品學院實驗室自制；樹脂型油類DNA提取試劑盒：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2 儀器設備

數顯pH計（PHS-3C）：上海儀電科學儀器股份有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-6）：常州普天儀器制造有限公司；多功能粉碎機（ST-07B）：上海樹立儀器儀表有限公司；離心機（GL-10000C）：上海安亭科學儀器廠；PCR 儀（FFG02HSD）：Bio-Techne（TECH）公司；超微量蛋白核酸分析儀（BioDrop Duo 80-3006-61）：英國柏點公司；微滴制備儀（QX200）、PCR 儀（T100）、微滴分析儀（QX200 Droplet）：美國BIO-RAD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

工藝流程見圖1。

圖1 工藝流程圖Fig.1 Flow chart

1.3.2 原料預處理

將轉基因大豆粉碎后，進行擠壓膨化預處理，條件為：套筒溫度70℃～120℃（四段溫度）；物料水分含量15%；主軸轉速375 r/min；蒸汽壓力0.5 MPa；?？卓讖? mm。

1.3.3 水酶法提取轉基因大豆油的單因素試驗

以油脂提取率為目標，通過單因素試驗對酶解參數進行優化，研究酶解參數即料液比、加酶量、酶解時間、酶解溫度和酶解pH值，設置4個因素不變，只改變1個因素，來確定各因素對油脂提取率的影響。各因素的范圍如下：pH 8.0～10.5，加酶量1.4%～2.2%，酶解時間 2 h～4.5 h，酶解溫度 40℃～65℃，料液比 1 ∶4（g/mL）～1 ∶8（g/mL）。

1.3.3.1 最適料液比的確定

取50 g擠壓膨化過的轉基因大豆粉（過80目篩）于錐形瓶中，加入料液比分別為 1 ∶4、1 ∶5、1 ∶6、1 ∶7、1∶8（g/mL）的蒸餾水，混勻，以1 mol/L的NaOH或HCl調整其pH值至9，加入2.0%的堿性蛋白酶，反應時間為4 h[16]，置50℃恒溫水浴鍋中反應，并用加速電動攪拌器不斷攪拌，使pH值穩定在9不變。反應結束后，于95℃上加熱10 min滅酶，5 000 r/min離心20 min。收集上層游離油放置在棕色玻璃瓶中，放入4℃冰箱內保存。通過提油率確定酶的最佳料液比，每個試驗做3個平行。

1.3.3.2 最適加酶量的確定

按1.3.3.1中操作步驟，根據確定的最佳料液比，將加酶量分別設置為 0、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%。通過提油率確定最適加酶量。

1.3.3.3 最適酶解時間的確定

按1.3.3.1中操作步驟，根據確定的最佳料液比、加酶量，將反應時間分別設置為 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h。通過提油率確定酶的最佳酶解時間。

1.3.3.4 最適酶解溫度的確定

按1.3.3.1中操作步驟，根據確定的最佳料液比、加酶量、酶解時間，將酶解溫度分別設置為35、40、45、50、55℃。通過提油率確定酶的最佳酶解溫度。

1.3.3.5 最適酶解pH值的確定

按1.3.3.1中操作步驟，根據確定的最佳料液比、加酶量、酶解時間、酶解溫度，將酶解pH值分別設置為 8.5、9.0、9.5、10.0、10.5。通過提油率確定酶的最佳酶解pH值。

1.3.4 分析檢測方法

1）水分的測定：參照GB/T 10362-2008《糧油檢驗玉米水分測定》。

2）粗脂肪的測定：參照NY/T 4-1982《谷類、油料作物種子粗脂肪測定方法》。

3）粗蛋白質的測定：參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》。

4）灰分的測定：參照GB 5009.4-2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》。

5）轉基因大豆提油率：

1.3.5 樣品DNA的提取

擠壓膨化后的轉基因大豆、水酶法處理擠壓膨化過的轉基因大豆后得到的水相和渣采用SDS法[19]（水相取1 mL，不加SDS，其他步驟一樣）提取DNA。

油相試劑盒嚴格按照說明書操作提取DNA。

1.3.6 引物及探針

數字PCR的引物及探針見表1。

表1 數字PCR的引物及探針Table 1 Primers and probes for digital PCR

1.3.7 數字PCR反應體系及程序

數字PCR的反應體系見表2，反應程序見表3。

表2 數字PCR的反應體系Table 2 Reaction system of digital PCR

表3 數字PCR的反應程序Table 3 Reaction procedure of digital PCR

1.3.8 數據處理

采用OriginPro 8.5軟件對試驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 轉基因大豆基本成分測定

轉基因大豆的基本成分見表4。

表4 轉基因大豆基本成分Table 4 Nutrient composition of genetically modified soybean

如表4所示，經過測定，轉基因大豆的粗脂肪含量為21.013%左右，這與實際相符。除上述測定的成分之外，大豆還含有部分的碳水化合物以及微量元素等。

2.2 水酶法提取轉基因大豆油單因素試驗結果

各因素對轉基因大豆提油率的影響結果見圖2。

圖2 各因素對轉基因大豆提油率的影響Fig.2 Effect of various factors on oil extraction rate of genetically modified soybean

各因素對水酶法提取轉基因大豆的提油率影響不同。由圖2A所示，隨著液體量增大，轉基因大豆的提油率呈現先增大后減小的趨勢，當料液比為1∶6（g/mL）時，提油率最大。這可能是由于水的加入，使蛋白質更大程度的溶出，從而酶解效率提高，提油率呈現增加的趨勢；但是，加水量到一定程度后，溶液的整體濃度降低，酶與底物的濃度也降低，這使得酶分子與底物分子的碰撞幾率減小，從而酶解效率降低，提油率呈現降低的趨勢。圖2B中，隨著加酶量的增加，轉基因大豆油的提油率呈現先增加后趨于穩定的趨勢，當加酶量大于1.8%時，提油率開始穩定。這是由于加酶量的增加，有利于蛋白質的降解，從而使提油率增加；但當加酶量超過一定程度時，底物被酶飽和，再增加加酶量，對酶解效果影響不大，從而提油率趨于穩定。圖2C中，隨著酶解時間的延長，轉基因大豆油的提油率呈現先顯著增加，后趨于穩定的趨勢。這是由于隨著酶解時間的增加，酶解愈加徹底，所以提油率隨之增加；但是當酶解時間達到4.0 h后，由于底物的減小，酶濃度的減小，抑制作用增加，這時再增加酶解時間，油脂也不再進一步釋放，提油率趨于穩定。圖2D中，隨著酶解溫度的提升，提油率呈現先增加后降低的趨勢。這是由于溫度升高，分子運動速度加快，酶分子與底物分子的碰撞幾率增加，所以酶解效率增加，提油率隨之增加；但是，當溫度升到35℃時，酶會發生變性，其活性中心會部分或者完全喪失催化活性，這時，酶解效率就會下降，提油率也隨之下降。圖2E中，隨著酶解pH值的增加，轉基因大豆的提油率呈現先增加后減小的趨勢。這是由于每一種酶都存在最適pH值的范圍，當反應體系的pH值接近這個范圍時，呈現的酶解效果最佳，從而提油率隨之增加；但是，當反應體系的pH值超過9.0時，酶解效果就相對降低，從而提油率隨之降低。因此提取的最佳工藝條件為：加酶量1.8%、酶解溫度35℃、酶解時間4.0 h、酶解 pH9.0、料液比 1 ∶6（g/mL）。

2.3 DNA提取結果

樣品DNA提取結果見表5。

表5 樣品DNA提取結果Table 5 DNA extraction results of each sample

DNA的純度主要取決于其在260 nm和280 nm處的吸光度，高質量DNA的A260/A280介于1.8～2.0之間，滿足這一條件的DNA在進行定性PCR擴增的時候，才可以最大可能的排除假陰性結果。如表5所示，用核酸測定儀分別測定所提DNA的A260/A280，經過擠壓膨化后的轉基因大豆粉、水酶法反應后得到的水相、油相和渣的A260/A280都在1.8～2.0之間，這說明所提DNA適用于后續的PCR反應。

2.4 數字PCR檢測結果

微滴式數字PCR儀測定各樣品的Lectin基因圖和EPSPS基因圖見圖3和圖4，分析結果見表6。

圖3 微滴式數字PCR儀測定各樣品的lectin基因圖Fig.3 Detection of lectin gene by digital PCR

圖4 微滴式數字PCR測定各樣品的EPSPS基因圖Fig.4 Detection of EPSPS gene by digital PCR

1 g擠壓膨化后的轉基因大豆經過水酶法（按照單因素結果進行酶解）離心得到約4.1 g的水相、0.8 g的固相、0.1 g油相，由于0.1 g膨化后的轉基因大豆、0.1 g水酶法得到的水相（密度為1.029 8 g/mL）以及0.1 g固相中所提的DNA體積為200 μL，水酶法得到的3 mL油相（密度為0.9010g/mL）中所提的DNA體積為20μL，以膨化過的轉基因大豆為例：針對Lectin基因，1 μL DNA最終拷貝數為73 600，0.1 g膨化后的轉基因大豆所提的DNA體積為200 μL，則0.1 g膨化后的轉基因大豆含有的Lectin基因的最終拷貝數為147.2×105，那么1 g擠壓膨化后的轉基因大豆含有的Lectin基因的最終拷貝數為147.2×106，以此類推經過換算：1 g膨化后的轉基因大豆含EPSPS基因的拷貝數為38×106；經過擠壓膨化得到的4.1 g水相中Lectin基因的拷貝數為95.776×106，占總拷貝數的65.065 2%，EPSPS基因的拷貝數為31.062×106，占總拷貝數的81.742 1%；0.8 g固相中Lectin基因的拷貝數為24.832×106，占總拷貝數的16.892 5%，EPSPS基因的拷貝數為4.288×106，占總拷貝數的11.2 842%；0.1 g油相中Lectin基因的拷貝數為252，占總拷貝數的0.000 2%，EPSPS基因的拷貝數為139，占總拷貝數的0.000 4%。總體上，在水酶法提油過程中，無論是轉基因大豆內源Lectin基因，還是外源EPSPS基因主要分布在水相中，這是由于DNA溶于水；其次分布于固相中，這是由于離心力的作用，使部分DNA沉淀于固相中，從而油相中DNA分布最少。轉基因大豆內源Lectin基因與外源EPSPS基因相比，外源EPSPS基因更易溶于水相。水酶法所得的油相中外源EPSPS基因所占比例與內源Lectin基因所占比例相差不大，水酶法工藝過程并不能使所得油脂中的外源EPSPS基因降解完全，由此可知，盡管水酶法所得的油脂中DNA含量很低，但是外源EPSPS基因仍然存在。

表6 數字PCR分析結果Table 6 Results of digital PCR

總體而言，水酶法工藝過程過于溫和，不能使轉基因大豆的內、外源基因發生明顯降解，但是由結果可知：水酶法提取得到水相中內、外源基因的含量最大，其次是固相中，大豆油中內、外源基因的含量微乎其微，但依然可以檢出。同時，水酶法所得水相、固相、油相的內源Lectin基因拷貝數之和占總拷貝數的81.957 9%，其EPSPS基因拷貝數之和占總拷貝數的93.026 7%，使得水酶法得到的水相、固相和油相中的基因含量總和不足100%，這說明除去誤差，也有部分內、外源基因發生了降解，但是總體而言，轉基因大豆內源Lectin基因降解量大于外源EPSPS基因，由此可知，轉基因大豆的外源EPSPS基因相比內源Lectin基因更加穩定，不易發生降解。

3 結論

大豆經擠壓膨化后，其細胞壁得到充分的破壞，脂肪聚集并且充分暴露在表面，有利于水酶法對油脂進行提取。離心分離后，游離油與水相分界明顯，可以直接對游離油進行收集，打破了常規以離心殘渣中殘油率為指標的提油率計算方法。

以擠壓膨化過的轉基因大豆粉為原料，以清油得率為指標，對酶解溫度、時間、pH值、加酶量以及料液比進行優化，通過單因素試驗，確定水酶法提取轉基因大豆油的最佳工藝條件為：加酶量1.8%、酶解溫度35℃、酶解時間4.0 h、酶解pH 9.0、料液比1∶6（g/mL）。

采用數字PCR對水酶法提取轉基因大豆油得到的水相、固相和油相中內、外源基因進行測定，發現水酶法得到的水相中轉基因大豆的內源基因占65.065 2%，外源基因占81.7421%；固相中內源基因占16.892 5%，外源基因占11.284 2%；油相中內源基因占0.000 2%，外源基因占0.000 4%。