功能性納米材料免疫層析技術在獸藥殘留檢測中的應用

胡高爽，高山

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050018）

隨著經濟的發展和人民生活水平的提高，動物源性食品安全逐漸成為當今世界人們所關注的焦點問題，獸藥殘留作為影響動物性食品安全的最主要因素之一[1]，近年來受到了廣泛關注。由于獸藥殘留在食品基質中的痕量性存在和復雜多樣性，針對其開發簡單快速、靈敏可靠的檢測方法，具有重要的研究價值和現實意義，是實行食品安全有效監管、保證食品安全的重要途徑。

目前，針對獸藥殘留檢測的方法有微生物法[2-3]、薄層色譜法[4]、毛細管電泳[5]、氣相色譜[6]、液相色譜[7]、色譜—質譜聯用技術[8]等，盡管上述的這些方法，可以被應用于獸藥殘留的有效檢測，但是他們存在一定的局限性。如儀器分析法，樣品預處理步驟繁瑣，需要萃取、分離、凈化、衍生化等，檢測時間長，且需要專業人員的操作和維護，不適合用于現場快速檢測，無法滿足食品安全監管過程中的快速、高效的要求。

免疫分析技術（immunoassay，IA），是一種基于抗原（或抗體）作為選擇性化學試劑特異性測定分析抗體（或抗原）的技術，具有專一性強、靈敏度高等優點[9-11]。其中免疫層析技術（如圖1所示）是建立在免疫分析技術和色譜層析技術基礎上的一項即時檢測技術，具有操作簡便、檢測快速、價格低廉且環境友好等優點，廣泛應用于食品安全檢測領域。近年來，面對我國食品安全中獸藥殘留多樣性和痕量性存在的特點，以及其在食品中持續動態變化的問題，出現了一些新型的基于功能性納米粒子的免疫層析技術，他們突破了傳統免疫層析技術在檢測速度和靈敏度上的技術瓶頸，為獸藥殘留快速、高靈敏檢測提供了新方法，也為食品危害因子的有效控制提供了新思路。

圖1 免疫層析試紙條示意圖Fig.1 Schematic illustration of the immunochromatographic strips

1 基于可視化納米材料的免疫層析技術

1.1 膠體金免疫層析技術

膠體金免疫層析技術主要是采用膠體金對相關抗體進行標記，當金標抗體聚集到一定密度時（一般要達到107個/mm2），就會形成肉眼可見的紫紅色，從而可對反應結果進行直觀測定的一種技術。膠體金免疫層析技術是目前針對獸藥殘留檢測中應用最為廣泛的一種免疫層析技術。

王碩等[12-16]以硝基呋喃類獸藥代謝物、四環素類獸藥、慶大霉素、喹諾酮類獸藥以及磺胺類獸藥等為研究對象，建立了一系列針對其檢測膠體金免疫層析試紙條，并應用于動物源性食品中獸藥殘留的可視化檢測。Wu songsong等[17]建立了基于膠體金的競爭免疫層析方法，實現了雞肉肌肉組織中金剛烷胺的快速靈敏檢測，檢測限能夠達到1.80 ng/mL。Byzoua等[18]利用膠體金免疫層析技術，實現了牛奶中氯霉素的快速檢測。然而，膠體金免疫層析技術使用膠體金作為抗體標記物，該方法的穩定性和靈敏度受到了一定的限制。

1.2 乳膠微球免疫層析技術

乳膠微球具有分散性好，粒徑均一，色彩鮮艷等特性。Wang chen等[19]利用乳膠微球建立了針對牛奶中喹諾酮類、磺胺類和四環素類抗生素同時檢測的免疫層析方法，并與傳統的膠體金免疫層析技術進行了對比，所得的檢出限顯著小于歐盟所規定的最大殘留限量（maximum residue limit，MRL），可以作為抗生素類獸藥檢測的方法。管笛等[20]建立了以彩色乳膠微球為標記物的免疫層析技術檢測豬尿液中的鹽酸克倫特羅，所建立方法的檢出限為0.013 ng/mL，回收率范圍為97.8%～106.0%之間。

1.3 其他新型可視化納米材料的免疫層析技術

納米碳是一種具有局部石墨化結構的無定形碳，外觀為黑色粉末狀固體，其基本粒子尺寸在10 nm～100 nm之間，具有穩定性好、易制備、無毒、不需要活化、靈敏度高及價格低廉等優點[21-22]。另外一種新型的納米標記材料為納米金-聚苯胺-納米金微球（nanogold-polyanilinenanogold microspheres，GPGs），它是一種在實驗過程中合成的納米材料。其基本反應原理[23]為：在酸性介質中，采用氯金酸水溶液氧化苯胺，使苯胺單體發生氧化聚合，氯金酸被還原成膠體金，包埋在聚苯胺中，形成納米金-聚苯胺復合物。再向聚合物中添加粒徑為20 nm左右的膠體金溶液，通過物理吸附形成納米金-聚苯胺-納米金微球（GPGs），得到的納米材料溶液穩定性良好，呈黑色。LIU等[24]利用膠體碳和納米金-聚苯胺-納米金微球構建了兩種新型的納米材料標記的免疫層析方法（如圖2所示），并用于動物源性食品中沙丁胺醇類獸藥殘留的檢測，由于其黑色信號與白色背景層析膜可形成強烈對比，因而具有較高的靈敏度，為新型納米標記物在免疫層析技術中的應用提供了新思路。然而，其檢測水平仍然只能達到定性或半定量級別，因此還需進一步開發可準確定量的其他配套檢測手段。

圖2 試紙條檢測不同濃度沙丁胺醇的結果Fig.2 Typical strip tests of standard solutions with different SAL concentration after assay procedure

2 基于熒光納米材料的免疫層析技術

2.1 熒光微球免疫層析技術

熒光微球是指將熒光染料通過物理吸附法、自組裝法、化學鍵合法、共聚法、包埋法等吸附或包埋到粒子內而形成的直徑在納米至微米級（0.01 μm～1 μm），受激發光源激發能發出熒光的固體微粒。通過表面修飾技術使微球表面攜帶親水性基團，使最終制備的熒光微球具有粒度均一、單分散性好、穩定性好、發光效率高、重復性好等特點，且具有較好的生物相容性[25-27]。因此，將其作為信號標記物應用于免疫層析技術，與膠體金免疫層析試紙條的原理相同，在質控線熒光強度一致的條件下，通過觀察檢測限熒光強度的消失，作為目標物的檢出限。但由于其使用熒光材料作為標記物，能夠顯著增強方法的靈敏度。

朱海等[28]將熒光微球與呋喃唑酮代謝物單克隆抗體共價耦聯在一起，以競爭法作為反應模式來制備出呋喃唑酮代謝物免疫層析試紙條，其靈敏度達1.0ng/mL，可滿足相關檢測標準要求，通過肉眼觀察檢測限和質控線之間的亮度，還可進行半定量檢測。宋春美[29]選擇具有優良發光性能的稀土配合物BHHCT-Eu3+為熒光材料，在反相微乳法合成SiO2的基礎上，制備了共價型稀土熒光納米顆粒，通過與鹽酸克倫特羅單克隆抗體偶聯，建立了基于熒光納米顆粒標記的鹽酸克倫特羅熒光免疫層析試紙。Bian等[30]利用熒光微球建立針對牛奶、血清和動物組織中頭孢氨芐類抗生素檢測的免疫層析方法，方法檢測限＜0.1 μg/L。Chen 等[31]利用200 nm熒光微球建立了牛奶中磺胺甲嘧啶殘留檢測的免疫層析法，在樣品中的檢出限能夠達到0.11 μg/L。Zhou等[32]同樣采用熒光微球免疫層析法（如圖3所示），建立了牛奶、蜂蜜、牛肉和豬尿中潔霉素快速檢測的方法。

近來，熒光猝滅的現象引起了科研工作者的注意[33-35]，由于相互靠近的供體與受體通過偶極子-偶極子相互作用而產生的非輻射性的過程，進而發生能量共振轉移出現熒光猝滅的現象，被廣泛的應用于生物檢測領域[36]，Shi等[35]利用熒光微球與膠體金之間發生熒光猝滅的現象，構建了新型免疫層析技術用于萊克多巴胺的檢測，方法相較于傳統免疫層析技術，檢測模式由信號turn-off轉變為turn-on型，使方法的靈敏度有了較大的提高，為針對獸藥殘留檢測的免疫層析技術向著高靈敏的發展提供新方向。

圖3 熒光微球免疫層析法測定潔霉素的結果Fig.3 Microsphere-based fluorescence immunochromatographic assay for monitoring lincomycin

2.2 量子點免疫層析技術

量子點（Quantum dots，QDs），是一種由 II-VI或者III-V族元素組成的準零維納米材料，通常它們的直徑為1 nm～10 nm之間[37-38]。由于量子限域效應，QDs具有很多特殊的光物理性質。（1）光穩定性好，可被重復激發，能保持數小時較強的熒光強度且不易漂白；（2）具有較寬的激發光譜。有一個比較廣泛的激發波長范圍；（3）尺寸依賴性的光學性能，同一激發不同發射，有利于同步檢測的應用[39]；（4）發射光譜窄，減少不同粒徑QDs發射光譜的重疊，有助于多標記檢測[40-41]。因此，QDs可以作為一種優越的熒光材料用于生物標記分析。

Berlina等[42]建立了基于量子點的新型熒光免疫層析方法用于牛奶中氯霉素的檢測，該方法針對氯霉素的檢出限能夠達到0.2 ng/mL，檢測時間不超過20 min。Taranova等[43]利用量子點尺寸效應，建立了基于不同發射波長量子點的牛奶中多種抗生素類獸藥殘留同時檢測的“交通燈”熒光免疫層析技術。

此外，在先前研究的基礎上[34，44-47]，根據熒光能量共振轉移的原理，利用發射波長為532 nm的量子點作為能量供體，吸收波長為520 nm的膠體金作為能量受測提供了新思路[49]。

圖4 磺胺類和喹諾酮類獸藥多殘留量子點熒光猝滅免疫層析檢測方法示意圖Fig.4 Schematic of QDs-based FQICS for the detection of SAs and FQs

2.3 上轉換免疫層析技術

上轉換納米粒子（Upconversion nanoparticles，UCNPs）是指受到光激發時，通過多光子機制發射比激發波長短的熒光的納米材料[50-51]，其基本組成包括基質材料、激活劑和敏化劑。由于UCNPs獨特的發光機制，長波長激發短波長發射，相較于傳統的有機染料作為生物標記材料，具有如下諸多優點[52-57]。（1）不易被光漂白，光化學性質穩定性高；（2）發光性能穩定，不受外界干擾，特別適合復雜生物樣本中的熒光標記；（3）長波長激發短波長發射，不遵循Stokes定律，可以大大降低背景的干擾，提高檢測靈敏度；（4）可通過控制摻雜元素的種類和比例，獲得不同發射波長，實現生物體系多組分同時檢測。

王金鵬[58]和張揚[59]利用性能優良的上轉換納米粒子，構建了上轉換免疫層析方法，并用于動物源性食品中喹諾酮類、磺胺類和沙丁胺醇等獸藥殘留的檢體，借助于免疫層析檢測的平臺，設計了一種新型信號turn-on模式的量子點熒光猝滅免疫層析檢測方法，并用于動物源性食品中磺胺喹惡啉獸藥殘留的快速檢測，相較于傳統膠體金免疫層析檢測方法，提高了免疫層析檢測技術的靈敏度[48]。在此基礎上進行進一步研究，針對食品多種潛在有害物共同存在的現狀，構建了基于量子點的多殘留熒光猝滅免疫層析方法（如圖4所示），用于動物源性食品中磺胺類和喹諾酮類獸藥的檢測，為免疫層析技術用于獸藥多殘留檢測。利用上轉換納米粒子與膠體金之間的能量共振轉移的原理，建立了基于上轉換的熒光猝滅免疫層析方法，并成功應用于磺胺喹惡啉獸藥的檢測[48]。然而，目前的研究缺乏相應的精準的檢測儀器，還沒有實現真正意義上的全定量分析。后續工作將致力于便攜式檢測儀器的制造或完善，實現全定量分析，并把可靠新穎的檢測方法帶出實驗室，真正應用于實際樣品的現場快速檢測。

3 基于磁性納米粒子的免疫層析技術

磁性納米粒子是新近發展起來的標記物，它是一種內部含有磁性金屬氧化物，表面覆蓋高分子有機材料的具有一定磁性和特殊性質的微球[60]。其作為標記物具有以下優勢：第一，免疫磁珠經過功能修飾之后，抗體是通過化學鍵結合到磁珠表面的，與之前膠體金、乳膠顆粒等的物理吸附不同，這種結合相對牢固，不易受到溫度濕度的影響，所以試劑的穩定性要遠遠優于膠體金、乳膠顆粒等顆粒標記物；第二，磁性納米粒子具有的超順磁性，在磁場中行為一致，響應性相同，呈現良好的單分散性，易于控制；第三，磁性材料只有在磁場中才會有磁性，而一般的生物樣品幾乎不表現出任何磁性。因此，檢測時背景值比較低，對于一些復雜的體系，樣品無需經過特殊處理即可得到較高的靈敏度，這一點非常適用于免疫層析技術的要求。目前，基于超順磁性磁珠的免疫層析技術作為新興的標記層析技術已經引起了研究者們的廣泛關注。

吳科盛[61]建立了磁分散固相萃取結合膠體金免疫層析試紙條定量檢測豬肉中克倫特羅的方法。結果顯示，基于磁分散固相萃取的膠體金免疫層析試紙條定量檢測法最低檢測限為0.10 ng/mL，定量限為0.24 ng/mL，該檢測方法應用于經LC/MS/MS確證為CLE陽性的9個實際豬肉樣本檢測，比對結果顯示，本研究所建檢測方法與確證方法的檢測結果具有較好的相關性。胡寅[62]以磁性Fe3O4納米粒子為材料，鹽酸克倫特羅為檢測對象，通過優化試驗反應條件，研究建立了基于Fe3O4磁性納米粒子的半定量膠體金免疫層析試紙條。結果表明，在優化條件下，該方法的檢測靈敏度與傳統的膠體金免疫層析試紙條相似，具有成本低、制作簡單、使用方便、能半定量檢測等優點。黃薇[63]建立了一種將免疫磁分離與免疫磁層析相結合的磁性免疫層析快速檢測新方法，并將其用于氯霉素殘留的快速檢測。該方法以超順磁性微球代替傳統的膠體金作為信號標記物，即可以通過肉眼觀察或光學比色法實現快速定性分析，又可以進一步利用超順磁材料特殊的磁信號實現免疫層析技術的定量化檢測。

此外，近來Razo等有科研工作者[64]將磁性納米顆粒與膠體金通過生物素-鏈霉親和素相結合作為雙重信號放大系統（如圖5所示），應用于免疫層析技術中檢測馬鈴薯X病毒，克服了傳統免疫分析技術前處理復雜、檢測信號弱的缺點。然而，其在獸藥殘留檢測中的應用還沒有開展，因此，將其應用于獸藥殘留的檢測具有潛在的研究價值。

圖5 所建立的雙重信號放大的免疫層析示意圖Fig.5 Proposed lateral flow immunoassay（LFIA）scheme with double amplification

4 展望

免疫層析技術作為快速檢測領軍先鋒發展迅猛，功能性納米材料具有更大的比表面積或者特定的功能，將其應用于免疫層析技術中，對于提高方法的性能有很重要的作用。本文綜述了近年來利用新型標記材料，如量子點、稀土發光材料、上轉換發光材料、熒光素等作為信號標記物在免疫層析技術應用的研究進展，這些新型研究技術突破了傳統膠體金免疫層析方法在靈敏度和穩定性等方面的不足，此外，配合新型信號讀數設備，克服了膠體金免疫層析技術只能實現定性半定量的缺點，實現了目標物的全定量分析檢測。

此外，近年來互補的核酸鏈之間的特異性結合，也被研究者應用于層析方法中。其中應用較為廣泛的為核酸適配體（Aptamer），它是一種對特定靶標物如小分子、金屬離子、生物大分子、細胞以及生物組織等具有選擇性識別功能的單鏈DNA或RNA序列。閆嬌[65]開發了一種基于適配體技術的快速檢測氯霉素的熒光試紙條的方法，檢測限可以達到1 nmol/L。該方法簡單快速，無需特殊和復雜的儀器，為開發基于適配體技術的抗生素及其他污染物快速現場檢測方法提供了一種新的思路，具有良好的應用前景。且與抗體相比，核酸適配體顯示出設計靈活、容易化學合成和修飾、成本低廉、生化穩定性好等優點。

隨著生物技術、納米技術、光電技術的發展及各學科的交叉融合，會有越來越多的新型標記材料、新型目標捕獲元件、新型檢測模式以及新型便攜化、微型化、自動化的定量檢測儀器出現，用于改善現有層析技術的各項性能，為食品安全監控提供直接、有效的方法，實現科學、合理地監測動物源性食品中獸藥殘留，為食品公司提升食品生產單位的運行管理水平，減少事故的發生，為相關監察部門節省巨大的檢測成本，從而創造巨大的間接經濟效益，同時也為食品安全事業做出更大的貢獻。