不同地區濃香型大曲質量指標與細菌群落相關性研究

吳

（1.四川理工學院釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川自貢643000；2.成都海關駐宜賓辦事處，四川宜賓644000）

“曲乃酒之骨”，大曲是白酒釀造中物系、微生物及酶系的載體，在白酒發酵過程中具有至關重要的糖化發酵生香的作用，其質量與白酒品質息息相關[1]。由于大曲制作過程中受原料、環境的影響較大，使得大曲中微生物情況十分復雜，其中含有大量不同種類的真菌和細菌，尤其是細菌類群極為豐富。

王曉丹等[2]對濃香型大曲中的酶系性能指標和白酒中的微量成分進行了檢測，探討了大曲酶系與白酒品質的關系，總結出大曲糖化力高，而蛋白水解酶、酯化酶活力低，長期使用，白酒質量和產量必然出現下降的趨勢。高亦豹等[3]運用PCR-DGGE技術對高溫和中溫大曲進行細菌的群落結構分析，結果表明Weissella cibaria、L.helveticus、L.fermentum、L.panis 等 乳 酸菌在大曲中普遍存在，而Thermoactinomyces sanguinis僅存在于高溫曲中。梁晨等[4]通過高通量測序技術對大曲貯存過程中原核微生物群落結構及風味成分的變化規律進行了研究，結果發現乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、高溫放線菌屬等是大曲中的優勢菌群，且大曲貯存有利于酸、醇、酯的積累且能降低異味物質含量。目前白酒行業還沒有制定出相對統一的大曲質量標準，因為不同地區、不同酒企所產大曲的各項指標及其中微生物種類均存在較大差異，因此為了深入了解不同產地濃香型大曲的差異，本試驗對四川3個地區的4個不同濃香型酒企所產大曲進行質量指標的測定，并通過高通量測序技術分析其細菌群落結構，并結合質量指標和細菌群落結構進行相關性分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲樣品分別取自宜賓（最高品溫60℃）、瀘州（最高品溫58℃）和遂寧（最高品溫均為55℃），每組樣品隨機取3個平行樣本，一部分置于-20℃冷藏用于大曲基因組的提取，另一部分4℃保存用于大曲質量指標的測定。

氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、可溶性淀粉、L-酪氨酸、干酪素、己酸、無水乙醇、葡萄糖（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；硫酸、鹽酸（均為分析純）：重慶川東化工有限公司；福林試劑：國藥集團化學試劑有限公司；飽和酚、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）（均 為 分 析純）：北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Trisbase）（分析純）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

Lynx6000型高效落地高速離心機、TSE240VULTS超低溫冰箱：美國Thermo公司；ChemiDoc XRS+型水平電泳儀：美國Bio-rad公司；UV-2000型紫外可見分光光度計：上海尤尼柯有限公司；DZKW-4型恒溫水浴鍋：北京中興偉業儀器有限公司；BS-2F數控恒溫搖床培養箱：常州精成國華儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大曲質量指標的測定方法

大曲水分、酸度、淀粉含量、糖化酶活力、酯化力、液化酶活力、發酵力、酸性蛋白酶活力均參考文獻[5]中的方法步驟。其中糖化酶活力的定義為1 g絕干曲40℃，pH4.6的環境下反應1 h后，將淀粉水解生成葡萄糖的毫克數，1 mg即1個酶活單位（U/g）。液化酶活力是指1 g絕干曲在60℃、pH 6的環境下反應1 h后，液化可溶性淀粉的克數，1 g即1個酶活單位（U/g）。蛋白酶活力定義為1 g絕干曲在40℃、pH值為3.0條件下1 min水解干酪素產生1 μg酪氨酸所需的蛋白酶量為1個酶活力單位（U/g）。

1.3.2 大曲基因組的提取

將同一大曲的3個平行樣本等量混合后進行DNA的提取，本試驗采用改良的CTAB[6]法提取大曲中微生物的基因組。

1.4 數據處理

大曲質量指標的試驗結果用平均值±標準差表示，使用SPSS 19.0軟件中的一般線性模型單因素Duncan法對數據進行方差分析和相關性分析。將高通量測序所得序列與Silva數據庫進行比對，獲得操作分類單位（operational taxonomic units，OTU）分類。再利用SPSS 19.0軟件對大曲質量指標和微生物群落結構進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同產地大曲的理化特征

水分、淀粉含量、酸度是衡量大曲質量的重要指標。通常質量等級為一級的大曲水分含量要求低于13%，淀粉含量低于58%，酸度控制在0.9 mmol/10 g～1.3 mmol/10 g之間[1]。本試驗通過比較4種不同地區大曲的理化特征，分析其差異，結果見圖1。

大曲水分含量的高低主要由制曲溫度、發酵情況和儲存時間等因素決定，較低的水分含量有利于降低微生物的生長代謝使得大曲易于保存。由圖1可知4種濃香型大曲的水分含量均在10%～14%之間，從高到低依次是遂寧1、瀘州、遂寧2、宜賓曲樣，且水分差異均達到顯著水平（P＜0.05），其中僅遂寧1大曲水分含量超過13%，表明各大曲均得到了良好的儲存，這將有利于大曲中復雜的菌系得以保存。

圖1 不同產地大曲理化差異Fig.1 Physical and chemical indicators diversity of different regions’Daqu sample

大曲中淀粉是作為微生物生長代謝的主要能量來源，其含量可以客觀反映在制曲過程中大曲的發酵情況。根據圖1的結果，4種大曲的淀粉含量在51%～59%之間，其淀粉含量高低依次是瀘州＞遂寧2＞遂寧1＞宜賓曲樣，且差異均達到顯著水平（P＜0.05），尤其是宜賓大曲的淀粉含量低于了52%。這說明大曲中微生物代謝較旺盛，大曲發酵良好，有助于大曲中淀粉酶、糖化酶等酶的積累，同時隨著大曲載體進入白酒釀造過程。

酸度的大小主要是由產酸微生物進行有機酸代謝以及脂肪、淀粉和蛋白質的降解[7]形成的，大曲酸度的大小在一定程度上揭示了產酸微生物的活躍性，也能在一定程度上反應出脂肪酶和蛋白酶活力的大小。4種曲樣的酸度相差不大，均維持在0.9 mmol/10 g～1.06 mmol/10 g，符合一級大曲的酸度范圍，其中遂寧2曲樣的酸度最高，且顯著高于其他3種曲樣（P＜0.05），可能含有更豐富的產酸菌。

2.2 不同產地大曲的酶活

大曲中的微生物在經過長時間的生長代謝后能不斷積累豐富的酶系，這些酶系對釀酒原料的利用及白酒的呈香呈味起著重要的作用。通過對大曲酶活的檢測，能較好的反應不同大曲之間的質量差異，檢測結果及酪氨酸標準曲線見圖2。

如圖2所示，4種曲樣的糖化酶活力在630 U/g～730 U/g之間，均具有較高水平，其中遂寧2和瀘州曲樣的糖化酶活力差異不顯著（P＞0.05），宜賓曲樣的糖化酶活力最高達到729.3 U/g，顯著高于其他3種曲樣；液化酶活力方面，4種曲樣均存在顯著的差異（P＜0.05），宜賓曲樣的液化酶活力最高，達1.75 U/g，而瀘州曲樣的液化酶活力最低，為1.00 U/g。遂寧兩個曲樣的液化酶活力在宜賓和瀘州曲樣之間。大曲中的液化酶和糖化酶主要是由霉菌產生，因此糖化酶和液化酶的酶活力的高低可側面反映出樣品中霉菌生長繁殖的差異。大曲的糖化酶和液化酶能促進原料中的淀粉轉化為可發酵性糖，可大大提高原料利用率和出酒率，因此高活力的糖化酶和液化酶有利于產酒。結合圖1各大曲淀粉含量的差異可得，淀粉含量相對低的大曲，其糖化力和液化力均較高。

由酪氨酸標準曲線計算可得，吸光常數K=95.14，在95～100范圍內，因此可作為常數用于計算酪氨酸含量。如圖2可得，遂寧1和瀘州曲樣酸性蛋白酶活力差異不顯著（P＞0.05），其余曲樣均差異顯著（P＜0.05），其中遂寧2曲樣的酶活最高，達到49.1 U/g，宜賓曲樣的酶活最低為28.8 U/g。白酒發酵是在酸性環境下進行的，大曲中的酸性蛋白酶能在該條件下將原料中的蛋白質水解成氨基酸，有助于美拉德反應的產生及其他風味物質的生成，因此酸性蛋白酶活力的高低對白酒風味的形成具有直接的影響。

圖2 不同產地大曲主要酶活差異Fig.2 The main enzyme activity diversity of different regions’Daqu sample

2.3 不同產地大曲的生化指標

發酵力和酯化力是反映大曲產酒和生香能力的重要指標，大曲酯化力越高則在白酒釀造過程中能產生更多的酯類化合物，發酵力反映了大曲中微生物的生長繁殖和發酵速度，可以在一定程度上考察大曲的發酵性能。4種曲樣的酯化力和發酵力測定結果如圖3所示。

遂寧1和遂寧2曲樣的酯化力分別為11.2 mg/（g·100 h）和13.6 mg/（g·100 h），無顯著差異（P＞0.05），宜賓和瀘州曲樣的酯化力較遂寧兩個曲樣高，分別達到24.5 mg/（g·100 h）和31.4 mg/（g·100 h）且差異顯著（P＜0.05）。發酵力方面，宜賓、遂寧2和瀘州曲樣的發酵力并無顯著差異（P＞0.05），均在0.24 g/（g·72 h）左右，而遂寧1曲樣的發酵力達0.57 g/（g·72 h）顯著高于其他曲樣，表明其在接入到發酵液后微生物的繁殖旺盛，呼吸作用較強，產氣較多。

圖3 不同產地大曲生化指標差異Fig.3 The biochemical indicators diversity of different regions’Daqu sample

2.4 細菌群落結構分析

2.4.1 各大曲樣品中細菌OTU分類

大曲樣品細菌Alpha多樣性指數見表1。

表1 大曲樣品細菌Alpha多樣性指數Table 1 Alpha diversity index of Daqu sample’s bacteria

OTU是在系統發生學或群體遺傳學研究中，為了便于進行分析，通過歸類操作，將序列相似性大于等于97%分歸為同一OTU。由表1可知，遂寧1和遂寧2曲樣OTU數最高，分別為163個和162個，其次是宜賓曲樣（96個），最低的是瀘州取樣（79個）；此外4個曲樣的優質序列分別為18 157條、29 172條、33 850條和25 974條。結合各大曲樣品的OTU數量和Ace、Chao等多樣性指數可判斷，遂寧1和遂寧2曲樣中的細菌群落多樣性高于宜賓和瀘州曲樣。由于制曲工藝的差別，遂寧兩個曲樣的最高品溫均為55℃，而宜賓和瀘州曲樣的最高品溫分別達到60℃和58℃，因此遂寧曲樣細菌多樣性更豐富的原因可能是由于其生產品溫相對較低，進而有利于各類微生物的生長和保存。

2.4.2 大曲樣品中細菌屬的分類

大曲樣品中細菌屬類分布情況見表2。

表2 大曲樣品中細菌屬類分布情況Table 2 The distribution of bacterial genus Daqu samples

由表2所示，除去豐度低于1%的菌屬（others），4種曲樣中一共得到20個優勢細菌屬類，其中，宜賓曲樣的優勢菌屬為魏斯氏菌屬（Weissella，25.23%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，19.96%）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces，16.26%） 和 糖 多 孢 菌 屬（Saccharopolyspora，14.79%）；遂寧 1曲樣中葡萄球菌屬（Staphylococcus，26.38%）、Kroppenstedtia屬（12.77%）和芽孢桿菌屬（Bacillus，9.73%）所占比例較高；遂寧2曲樣占主導地位的菌屬為葡萄球菌屬（Staphylococcus，31.62%）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora，15.87%）、Kroppenstedtia屬（11.64%）和芽孢桿菌屬（Bacillus，9.48%）；此外，乳桿菌屬（Lactobacillus，28.96%）、魏斯氏菌屬（Weissella，27.66%）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces，13.12%）、片球菌屬（Pediococcus，7.39%）在瀘州曲樣中為優勢菌屬。整體來看，宜賓和瀘州曲樣的占主導地位的細菌類群更為相似，魏斯氏菌屬、高溫放線菌屬等均占較高比例，與王彩虹[8]得到的濃香型大曲優勢菌屬較為一致；但與之不同的是遂寧兩個曲樣中葡萄球菌屬、Kroppenstedtia屬、芽孢桿菌屬、糖多孢菌屬（Saccharopolyspor）均占其主導地位，各大曲之間細菌類群和而不同，可能正是由于這種微生物的差異性，導致不同產地的濃香型白酒各具特色。因為不同的微生物類群對白酒釀造具有不同的功能和影響，其代謝產物對白酒的風味具有直接的影響，微生物釀造性能的不同是導致同一香型白酒各具特色的主要原因之一。如：魏斯氏菌屬（Weissella）屬于乳酸細菌，具有代謝乳酸的能力[9]，進而生成乳酸乙酯，是白酒釀造中的主要微生物之一[10]。葡萄球菌屬（Staphylococcus）廣泛分布于土壤、空氣、水、灰塵中[11]，在釀造工業有多次報道[12-13]，但未見其在白酒生產中具有的功能研究。芽孢桿菌屬（Bacillus）因能形成芽孢而對環境具有極強耐受性，是白酒釀造中產酶生香的重要微生物之一[14]。糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）屬于放線菌綱下的一類微生物[15]，能產生酶類、維生素、纖維素降解促進因子等，是一類安全的生物資源菌，在濃香型大曲中普遍存在。高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）具有耐高溫、生長快的特點，通常中高溫大曲的生產品溫會超過55℃，因此高溫放線菌由于其耐高溫及其產蛋白酶和纖維素酶[16]的特性對大曲生產乃至白酒釀造過程中均具有重要作用。因此，大曲的生產過程，實際也是富集菌群，積累酶系的過程。

2.5 大曲微生物群落與質量指標的相關性分析

利用SPSS數據分析軟件，選擇在屬分類下樣品中豐度大于1%的菌屬與液化酶、糖化酶、酯化力、發酵力、蛋白酶、酸度進行Pearson相關性分析，研究大曲微生物群落結構與各質量指標的相互關系，細菌群落結果如表3所示。

表3 大曲細菌群落與質量指標相關性分析Table 3 Daqu bacteria and quality indexs correlation analysis

由表3可知，在所考察的細菌屬中沒有與酸度、糖化酶和液化酶呈顯著相關的菌屬；與酯化力有顯著相關性（P＜0.05）的菌屬有魏斯氏菌屬（Weissella）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus），其中魏斯氏菌屬（Weissella）與大曲酯化力呈顯著正相關（P＜0.05），片球菌屬（Pediococcus）呈極顯著正相關（P＜0.01），葡萄球菌屬（Staphylococcus）與酯化力呈負極顯著相關（P＜0.01），乳球菌屬（Lactococcus）呈極顯著負相關（P＜0.01），說明大曲的酯化力高低是由復雜的微生物群落間共同作用的結果；與發酵力有顯著相關（P＜0.05）的菌屬為鏈霉菌屬（Streptomyces）和短狀桿菌屬（Brachybacterium），鏈霉菌屬（Streptomyces）呈正相關，短狀桿菌屬（Brachybacterium）呈極顯著正相關（P＜0.01）；不動桿菌屬（Acinetobacter）與酸性蛋白酶活力呈極顯著正相關。因此，在進一步的研究中，將重點關注那些與質量指標相關性顯著的菌群，以進一步探討微生物對大曲質量的影響。

3 結論

對4個不同酒廠曲樣的水分、淀粉、酸度、糖化酶活力、發酵力等質量指標進行測定和分析，結果表明宜賓曲樣的水分、淀粉含量和酸性蛋白酶活力顯著低于其它曲樣（P＜0.05），而糖化酶活力和液化酶活力顯著高于遂寧和瀘州曲樣（P＜0.05）；遂寧1曲樣的水分和發酵力顯著高于其它曲樣（P＜0.05），其糖化酶、液化酶和酸性蛋白酶活力均處于中上水平；遂寧2曲樣的酸度和酸性蛋白酶活力顯著高于其它曲樣（P＜0.05），而其他指標在4個曲樣中處于中下水平；瀘州曲樣的淀粉含量和酯化力最高，且顯著高于遂寧和宜賓曲樣（P＜0.05），但液化酶和糖化酶活力較低，且液化酶活力顯著低于其他曲樣。綜合來看，不同產地的大曲樣品質量指標存在差異，但又各有所長。通過對細菌群落結構進行分析可得，遂寧兩個曲樣的細菌群落多樣性均高于宜賓、瀘州曲樣。微生物群落方面，宜賓和瀘州曲樣的占主導地位的細菌類群更為相似，魏斯氏菌屬、高溫放線菌屬等均占較高比例；而遂寧兩個曲樣中葡萄球菌屬、Kroppenstedtia屬、芽孢桿菌屬、糖多孢菌屬（Saccharopolyspor）均占其主導地位。結合大曲細菌群落結構與各質量指標進行相關性分析發現，魏斯氏菌屬（Weissella）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）與大曲酯化力的相關性達到顯著水平（P＜0.05），片球菌屬（Pediococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）與大曲酯化力的相關性達到極顯著水平（P＜0.01），因此可推斷大曲的酯化力高低是由復雜的微生物群落間共同作用的結果；鏈霉菌屬（Streptomyces）和短狀桿菌屬（Brachybacterium）與發酵力呈顯著相關（P＜0.05）；而酸性蛋白酶活力僅與不動桿菌屬（Acinetobacter）呈極顯著正相關。通過本研究能充分了解不同地區濃香型大曲的質量指標及細菌群落的差異，進而加深對不同產地濃香型白酒特色風格的認識，從而推進四川濃香型白酒行業的發展。