分子蒸餾法富集茶樹油特征成分的研究

牛彪，梁妍，梁劍平，劉宇

（中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，農業部獸用藥物創制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州730050）

茶樹油（tea tree oil，TTO）也稱互葉白千層油，從桃金娘科互葉白千層樹的葉和嫩枝中利用水蒸氣蒸餾法提取得到的一種無色至淡黃色油狀液體，具有怡人的芳香氣味。屬白千層萜品型香料油，具有良好的殺菌抑菌及保健作用。原產于澳大利亞的新南威爾士州和新西蘭的部分地區[1]。中國自20世紀90年代開始，先由廣東、廣西、海南、福建、云南等地開始引種，并形成一定的種植規模，茶樹精油具有良好的廣譜殺菌抑菌及保健作用，可抗病毒[2]、抗菌[3-4]、激活免疫因子[5]、抗寄生蟲[6]、抗氧化防腐促進傷口愈合[7]，是一種可替代抗生素的優良天然抗菌劑，無毒無公害[8]。

分子蒸餾技術[9]（molecular distillation）是一種特殊的液——液分離技術，通過不同物質分子運動平均自由程的不同而實現分離，這和傳統蒸餾技術借助沸點不同實現分離完全不同，該技術運用導熱油控制溫度，在一定的溫度下，混合物被加熱后，有一部分輕分子運動大于平均自由程后被冷凝后收集至輕組分收集瓶，重組分未被冷凝流入重組分收集瓶。從而達到分離的目的。本文主要從影響分子蒸餾的4個關鍵因素出發，即蒸餾溫度、進樣速率、刮膜器轉速、蒸餾壓力，以期對茶樹油工業化利用、生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶樹油：天津中澳嘉喜諾生物科技有限公司；松油烯-4-醇對照品：北京索萊寶科技有限公司產品；1，8-桉葉素對照品：上海麥克林生化科技有限公司產品；正己烷（色譜級）：天津市科密歐化學試劑有限公司產品；導熱油（二甲基硅油）、泵油：北京四方物料有限公司。

1.2 儀器與設備

FMD-60刮膜式分子蒸餾裝置：杜馬斯儀器（上海）有限公司；Aligent 7890A毛細管氣相色譜儀、氫火焰離子檢測器（FID）：美國安捷倫公司產品；BT25S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司產品。

1.3 方法

本試驗采取單因素研究方法，對每一餾分運用氣相色譜法進行測定，得到松油烯-4-醇、1，8-桉葉素相對含量，再結合正交試驗得到松油烯-4-醇、1，8-桉葉素的最佳工藝參數。

1.3.1 單因素考察[10]

根據相關資料顯示，分子蒸餾法富集茶樹油中特征成分與蒸餾溫度、進料速率、刮膜器轉速、蒸餾壓力有關，因此，首先通過單因素試驗來考察茶樹油的富集工藝。

1.3.1.1 蒸餾溫度的考察

用量筒準確量取茶樹油20mL，從進料口加入，在蒸餾壓力100 Pa，進料速率1 mL/min，刮膜轉速360 r/min條件下，考察蒸餾溫度的變化對茶樹油中特征成分含量的影響。其中，溫度由高溫循環系統通過導熱油控制，冷凝裝置采用低溫循環系統冷卻水控制。

1.3.1.2 蒸餾壓力的考察

在蒸餾溫度46℃，進料速率1 mL/min，刮膜轉速360 r/min條件下，考察蒸餾壓力的變化對茶樹油中特征組分含量的影響。

1.3.1.3 進料速率的考察

在蒸餾溫度46℃，蒸餾壓力100 Pa，刮膜轉速360 r/min條件下，考察進料速率的變化對茶樹油中特征組分含量的影響。

1.3.1.4 刮膜轉速的考察

在蒸餾溫度46℃，蒸餾壓力100 Pa，進料速率1 mL/min條件下，考察刮膜轉速的變化對茶樹油中特征組分含量的影響。

1.3.2 氣相色譜對特征組分的測定

1.3.2.1 氣相色譜條件[11]

毛細管色譜柱Aligent DB-FFAP（30 m×0.32 mm，0.5 μm），FID 檢測器，進樣口溫度 240℃，檢測器溫度240℃，進樣量 1 μL，柱溫從 50℃起，保持 1 min，以5℃/min的速率升至200℃，保持2 min，分流比50∶1，氣體流速1.3 mL/min，恒線流速，載氣為氮氣。

1.3.2.2 對照品溶液的配制

精密稱取1，8-桉葉素對照品 5μL（4.1mg）、松油烯-4-醇對照品 60 μL（55.75 mg），將兩者置于同一 10 mL容量瓶，用正己烷定容至刻度，搖勻，得1，8-桉葉素濃度為0.41 mg/mL，松油烯-4-醇濃度為5.575 mg/mL。

1.3.2.3 供試品溶液配制

精密稱取茶樹油樣品75 μL（71.3 mg）用正己烷定容至10 mL容量瓶；精密稱取單因素條件下各餾分輕、重組分60 μL定容于10 mL容量瓶，搖勻，即得。

1.3.2.4 線性關系考察

精密吸取“1.3.2.2”項下的對照品溶液，用倍比稀釋法稀釋成6個濃度。分別取以上濃度對照品1 μL注入氣相色譜儀，以色譜峰面積（A）為縱坐標，進樣濃度（C）為橫坐標繪制標準曲線。通過氣相外標法得出各餾分中特征組分（1，8-桉葉素、松油烯-4-醇）的含量。

1.3.2.5 特征組分含量的測定

取“1.3.2.2”項供試品溶液 1 μL 按“1.3.2.1”項氣相色譜條件進行檢測，按“1.3.2.4”及公式（1）得出結論：

式中：c為特征組分的濃度，mg/mL；v為定容的體積數，mL；M為供試品的質量，mg；m為相對含量。

1.3.2.6 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，結合1，8-桉葉素、松油烯-4-醇蒸餾得率，選擇對1，8-桉葉素、松油烯-4-醇影響較大的蒸餾溫度、蒸餾壓力、進料速率及刮膜轉速為正交因素，設定3個水平，以特征組分的相對含量為考察指標，建立L9（34）正交試驗表安排試驗。

2 結果與分析

2.1 單因素對茶樹油輕、重組分質量的考察結果

2.1.1 蒸餾溫度對組分含量的影響

蒸餾溫度對組分含量的影響見圖1。

圖1 蒸餾溫度對組分含量的影響Fig.1 Effect of distillation temperature on component content

從圖1中可以看出，輕組分呈現先增后降再增加的趨勢，重組分卻一直在降低。這可能因為在較低溫度下，茶樹油中少部分輕分子在刮膜轉速作用下先溢出進入輕組分，此時溫度未達到汽化溫度，輕、重組分未完全分離，隨著溫度的升高，茶樹油被汽化進入輕組分，質量迅速增加直至穩定，重組分由于輕組分的溢出出現逐漸降低的趨勢。

2.1.2 蒸餾壓力對組分含量的影響

蒸餾壓力對組分含量的影響見圖2。

圖2 蒸餾壓力對組分含量的影響Fig.2 Effect of distillation pressure on component content

從圖2中得出，壓力在40 Pa～110 Pa時，輕組分含量逐漸降低，重組分含量勻速升高，之后兩者均緩慢降低，這是因為在46℃時，茶樹油中大多數輕分子已進入輕相，隨著蒸餾壓力的升高，輕分子不能被汽化而進入輕相，只能保留在重相。

2.1.3 進料速率對組分含量的影響

進料速率對組分含量的影響見圖3。

圖3 進料速率對組分含量的影響Fig.3 Effect of feed rate on component content

從圖3中可看出，輕組分含量呈先升高再降低后升高的趨勢，重組分含量呈先緩慢降低再升高的趨勢。因為在較低進料速率（小于1 mL/min）時，輕組分汽化進入輕相，而當進料速率逐漸增大時，輕組分不能完全被汽化只能再進入重相，呈現出重組分含量升高的趨勢。因此，要將輕重組分很好地分離開，且易揮發的茶樹油蒸餾時間過短或過長都會影響各組分的成分。

2.1.4 刮膜轉速對組分含量的影響

刮膜轉速對組分含量的影響見圖4。

圖4 刮膜轉速對組分含量的影響Fig.4 Effect of scraping speed on component content

從圖4中可以得出：輕組分含量出現先降低后增高的趨勢，重組分含量則逐漸升高直至保持穩定。由于刮膜轉速越大，分子之間的平均自由程相對增大，致使大部分分子運動小于平均自由程而進入重相，使得重組分含量逐漸升高，輕組分含量降低，當轉速大于360 r/min時一部分重分子被刮膜后變成了輕分子，使得輕分子含量開始小幅度升高。

2.2 線性關系考察結果

按“1.3.2.3”中的相關內容，得出相關線性關系及氣相圖譜，見圖5～圖8。

圖5 1，8-桉葉素標準曲線Fig.5 1，8-cineole standard curve

圖6 松油烯-4-醇標準曲線圖Fig.6 Terpinene-4-ol standard curve

由圖5～圖8得到：1，8-桉葉素回歸方程為：A=439.21C-0.256 8，r2=0.999 98，松油烯-4-醇回歸方程為：A=337.653C-3.751，r2=0.999 93?？梢?1，8-桉葉素在0.012 977 mg/mL～0.410 960 mg/mL與峰面積之間具有良好的線性關系，松油烯-4-醇在0.181 451 mg/mL～5.600 60 mg/mL與峰面積之間具有良好的線性關系。

圖7 茶樹油對照品色譜圖Fig.7 Tea tree oil reference chromatogram

圖8 茶樹油樣品色譜圖Fig.8 Tea tree oil sample chromatograms

2.3 特征成分含量測定結果

按照“1.3.2.5”的內容測得茶樹油中1，8-桉葉素和松油烯-4-醇的相對含量，結果見表1。

表1 茶樹油中特征組分含量測定Table 1 Determination of characteristic components in Tea Tree Oil

2.4 單因素條件下各餾分中特征組分的含量

各單因素條件下輕組分及重組分中特征成分的含量，其具體結果分別見表2～表5。

從表2可以看出，輕組分中含有的1，8-桉葉素含量明顯高于重組分，但松油烯-4-醇含量卻相反，輕組分1，8-桉葉素相對含量隨溫度升高呈現先增后降的趨勢，且在38℃時達到最大3.70%，但結合圖1，38℃時分離得到的輕組分卻很少，46℃時分離得到的輕、重組分相對較多，且輕組分中1，8-桉葉素的相對含量較多，達到3.66%；松油烯-4-醇的相對含量在重組分中隨溫度的升高呈現先增后降的走勢，且在46℃時達到了最大56.03%。因此，選擇46℃為1，8-桉葉素、松油烯-4-醇正交試驗考察點。

表2 不同蒸餾溫度下各組分特征成分含量Table 2 Characteristic composition of each component at different distillation temperatures

表3 不同蒸餾壓力下各組分特征成分含量Table 3 Characteristic composition of each component at different distillation pressure

表4 不同進料速率下各組分特征成分含量Table 4 Characteristic composition of each component at different feed rate

從表3可以看出，輕組分中含有的1，8-桉葉素含量明顯高于重組分，但松油烯-4-醇含量卻相反，輕組分1，8-桉葉素相對含量隨壓力增加呈現先增后降的趨勢，且在110 Pa時達到最大4.10%；松油烯-4-醇相對含量在重組分中隨壓力增加呈現先增后降的走勢，且在110Pa時達到了最大55.45%。結合圖2，在110Pa時分離得到的兩者都較多。因此，選擇110 Pa為1，8-桉葉素、松油烯-4-醇正交試驗考察點。

從表4可以看出，輕組分中含有的1，8-桉葉素含量明顯高于重組分，松油烯-4-醇在重組分中含量相對較高，輕組分1，8-桉葉素相對含量隨進料速率增加呈現先降后增的趨勢，且在2.5 mL/min時達到最大3.82%；松油烯-4-醇相對含量在重組分中隨進料速率增加呈現先降后增的走勢，含量相差不大，且在2.5mL/min時達到了最大55.65%。結合圖3，2.5 mL/min時分離得到的兩者都較多。因此，選擇2.5 mL/min為松油烯-4-醇正交試驗考察點。

從表5可以看出，輕組分中含有的1，8-桉葉素含量明顯高于重組分，松油烯-4-醇在重組分中含量相對較高，輕組分1，8-桉葉素相對含量隨刮膜轉速增加呈現先降后增的趨勢，且在450 r/min時達到最大3.85%；松油烯-4-醇相對含量在重組分中隨刮膜轉速增加呈現先增后降的走勢，且在450 r/min時達到了最大56.54%，再結合圖4，可知，在450 r/min時1，8-桉葉素、松油烯-4-醇兩者含量相對較高。所以，選擇450 r/min為正交試驗考察點。

表5 不同刮膜轉速下各組分特征成分含量Table 5 Characteristic composition of each component at different scratch film speed

2.5 正交試驗因素水平及相關結果

按照“1.3.2.6”的內容，結合如下正交試驗因素水平（表6），以輕組分中1，8-桉葉素及重組分中松油烯-4-醇相對含量為考察指標，得到如下正交試驗及相關結果，見表7～表10。

表6 正交試驗因素水平Table 6 Factors and levels of orthogonal experiment

表7 1，8-桉葉素正交試驗及相關結果Table 7 Orthogonal experiment and related results of 1，8-cineole

由表7可知，正交因素對輕組分中1，8-桉葉素的影響順序為：D＞B＞C＞A，即刮膜轉速對輕組分中1，8-桉葉素富集影響最大，其次為蒸餾壓力和進料速率，蒸餾溫度對1，8-桉葉素的富集影響相對較小。條件以A1B2C2D2為最佳，即蒸餾溫度38℃，蒸餾壓力110 Pa，進料速率2.5 mL/min，刮膜轉速450 r/min。由表8可知，蒸餾壓力、進料速率及刮膜轉速對輕組分中1，8-桉葉素含量影響較為顯著，差異具有統計學意義。蒸餾溫度對1，8-桉葉素影響差異不明顯。

表8 1，8-桉葉素方差分析Table 8 Variance analysis of 1，8-cineole

表9 松油烯-4-醇正交試驗及相關結果Table 9 Orthogonal experiment and related results of Terpinen-4-ol

表10 松油烯-4-醇方差分析Table 10 Variance analysis of Terpinen-4-ol

由表9可知，正交因素對重組分中松油烯-4-醇的影響順序為：A＞B＞D＞C，即蒸餾溫度對重組分中松油烯-4-醇富集影響最大，其次為蒸餾壓力和刮膜轉速，進料速率對松油烯-4-醇的富集影響相對較小。條件以A1B2C3D2為最佳，即蒸餾溫度38℃，蒸餾壓力110 Pa，進料速率3 mL/min，刮膜轉速450 r/min。由表10可知，蒸餾溫度對重組分中松油烯-4-醇含量影響極為顯著，蒸餾壓力對重組分中松油烯-4-醇含量影響較為顯著，差異具有統計學意義。進料速率及刮膜轉速對松油烯-4-醇影響不明顯。

2.6 正交試驗的工藝驗證

取上述試驗相同的茶樹油20 mL，共3份，按蒸餾溫度38℃，蒸餾壓力110 Pa，進料速率2.5 mL/min，刮膜轉速450 r/min的工藝條件進行分離，計算輕組分中1，8-桉葉素的相對含量。同理在蒸餾溫度38℃，蒸餾壓力110 Pa，進料速率3 mL/min，刮膜轉速450 r/min的工藝條件下計算重組分中松油烯-4-的相對含量，結果見表11。

表11 提取工藝驗證表Table 11 Extraction process validation

由表11可以發現：在最優條件下，1，8-桉葉素的相對含量平均值達到5.33%，RSD值1.42%；松油烯-4-醇相對含量達到65.17%，RSD值為1.85%。

3 結論和討論

本研究通過單因素試驗分析了蒸餾溫度、蒸餾壓力、進料速率和刮膜轉速4個因素對茶樹油中1，8-桉葉素和松油烯-4-醇分離效果的影響，依據所確定的因素，設計了四因素三水平的正交試驗，進一步優化了分離工藝，為深入開發利用茶樹油提供理論基礎。1，8-桉葉素和松油烯-4-醇是茶樹油的特征組分，但由于1，8-桉葉素在茶樹油中含量較低，傳統的分離技術很難達到預期的效果，導致利用率相對較低。運用刮膜式分子蒸餾技術在合理的條件下能夠將1，8-桉葉素和松油烯-4-醇進行富集，從而研究各自的藥理活性。

本研究所用的茶樹油經氣相質譜檢測其1，8-桉

（）（）葉素的相對含量為2.764%，松油烯-4-醇為43.416%，通過分子蒸餾技術將1，8-桉葉素相對含量提升至5.33%，松油烯-4-醇的含量提升至65.17%，富集效果明顯，但仍不能滿足應用需求，這或許和單因素試驗中因素數值設立的不夠合理有關，通過多級分子蒸餾能夠進一步的提升富集程度，從而達到應用要求，但還需不斷摸索。