復合酶提取洋蔥多糖的工藝研究

陳曦，張黎，羅建紅，劉林昌，劉義武，黃輝

（內江師范學院化學化工學院，四川內江641199）

洋蔥是一種獨特的辛辣食物，具有非常復雜的營養成分。洋蔥的黃酮醇、槲皮素和槲皮素衍生物是許多國家膳食類黃酮的主要來源之一，作為食品成分、抗氧化劑和抗褐變生物活性化合物來源具有較好的發展潛力[1-3]。多糖是洋蔥的主要活性物質之一，洋蔥多糖是α-糖苷鍵連接單糖的多聚物，其純度及結構直接影響生物活性，是洋蔥多糖研究的重點[4]。洋蔥多糖具有抗腫瘤、降血脂、降血糖和抗衰老等功能，成為近年來研究熱點[1-7]。

提取方法會影響洋蔥多糖的純度和結構，進而影響其生物活性。不同提取液連續提取也使洋蔥多糖中不同單糖的含量不同，醋酸鈉緩沖液提取多糖中甘露糖含量達81.68%，醋酸鈉緩沖液加入草酸銨和乙二胺四乙酸二鈉螯合劑提取的多糖半乳糖含量為67.59%[3]。洋蔥多糖的提取方法有熱水提取法、酶輔助提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法和超臨界流體萃取法等[2，4]。酶解反應條件溫和，提高多糖收率，同時也減少蛋白質含量。采用酶輔助提取法還能最大限度地保留洋蔥多糖的生物活性，并降低提取成本[8-9]。周文俊等[7]研究了酶法提取洋蔥多糖及其抗氧化性，傅東和等[10]研究了纖維素酶提取洋蔥多糖的工藝，李健鳳等[11]研究了復合酶法提取洋蔥多糖，均表明酶輔助提取提高了多糖收率。洋蔥多糖的提取基本上都有利用Sewage（氯仿 ∶正丁醇=4 ∶1）法脫蛋白這一步[2，7]。張強等[12]認為洋蔥多糖脫蛋白的最佳方法是胰蛋白酶+Sewage法。酶法能減少蛋白質含量，適合的酶組合可以進一步降低蛋白質含量，從而省略Sewage法脫蛋白這一步，因此可以簡化提取工藝。本文以纖維素酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶組成復合酶，探究洋蔥多糖的最佳提取條件，利用植物蛋白酶的穩定性，復合酶的高效性，縮短工藝周期，降低成本，高效地提取洋蔥多糖，使酶法提取多糖技術進一步成熟。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

本地產的新鮮成熟洋蔥。

1.1.2 試劑

纖維素酶（1 800 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）（均為生物試劑）：上海金穗生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、檸檬酸、濃硫酸、葡萄糖、無水乙醚、苯酚、丙酮、無水乙醇（均為分析純）：成都金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-9140A電熱鼓風干燥機：成都鑫益儀器有限公司；TDL-5-A臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；SHZ-82型水浴恒溫振蕩器：江蘇省金壇市醫療儀器廠；T6新世紀紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 洋蔥多糖提取

1.3.1 洋蔥原料的處理

將購置的新鮮洋蔥切碎，40℃干燥，粉碎，備用。稱取50 g洋蔥粉末于250 mL三角瓶中，再向內加入200 mL 80%乙醇，85℃回流脫脂2.5 h，2次，40℃干燥。

1.3.2 洋蔥多糖的提取

參考文獻[13-14]的提取方法，略微修改。稱取洋蔥粉末2.000 g，置于250 mL燒杯中，加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，取一定量纖維素酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶按質量比2∶2∶1比例混合的復合酶制劑，將其加入到洋蔥溶液中，在恒溫振蕩器上酶解一定時間，沸水浴中滅酶15 min，離心。在上清液中，加入3倍體積的85%乙醇，4℃靜置過夜。離心，沉淀依次用無水乙醇，無水乙醚，丙酮洗滌，40℃干燥，得洋蔥多糖粗產品。

1.4 正交試驗設計

在單因素試驗基礎上，設計L16（45）正交試驗（見表1），以洋蔥多糖收率和純度為評價標準，確定最佳工藝。

表1L16（45）正交試驗因素與水平設計Table 1Factors and levels of L16（45）orthogonal design

1.5 洋蔥多糖的測定[15-16]

準確稱取烘干的洋蔥多糖粗產品0.010 g，配制成100 μg/mL樣品溶液。在25 mL比色管中加入2.00 mL樣品，4.00 mL水，2.00 mL 6%苯酚溶液，搖勻，再加入10.00 mL濃硫酸，搖勻，冷卻后40℃加熱30 min，冷卻，測定490 nm的吸光度。

洋蔥多糖收率X計算方法

洋蔥多糖純度Y計算方法：

式（1）中：m為提取到的粗品洋蔥多糖質量，g；M是洋蔥原料質量，g；Y為洋蔥多糖純度。

式（2）中：m為稱取的粗品洋蔥多糖質量，g；C為測定出來的多糖濃度，μg/mL。

2 結果與討論

2.1 標準曲線的建立

準確稱取葡萄糖標準品0.100 0 g溶于1 000 mL容量瓶，配制成100 μg/mL標準溶液。避光保存。采用苯酚硫酸法[15-16]，準確移取葡萄糖標準溶液0.80、1.60、2.40、3.20、3.60 mL，分別置于 25 mL 比色管中，并分別用去離子水補至4.00 mL，再加入2.00 mL 6%的苯酚溶液，搖勻，加入10.00 mL濃硫酸，搖勻，冷卻后40℃加熱30 min，冷卻，以去離子水作空白，測定490 nm的吸光度，得回歸方程：A=0.042 38×C-0.0522 4，R=0.999 8。式中：A為吸光度；C為溶液中葡萄糖濃度。

2.2 復合酶比例確定

控制pH值6.0，酶解溫度55℃，酶解時間90 min，料液比1∶40（g/mL），考察纖維素酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶分別加入0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%時洋蔥多糖收率和純度。結果表明：當分別加入纖維素酶0.2%，木瓜蛋白酶0.2%，中性蛋白酶0.1%時洋蔥多糖純度最佳，分別為：54.53%、45.36%、62.36%。所以復合酶最佳配比為纖維素酶∶木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶=2∶2∶1。

2.3 單因素對洋蔥多糖提取的影響

2.3.1 酶濃度的影響

控制pH值6.0，酶解溫度55℃，酶解時間90 min，料液比1∶40（g/mL），考察復合酶加入量分別為0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.0%時洋蔥多糖收率與純度。圖1為酶濃度對洋蔥多糖收率與純度的影響。

圖1 酶濃度的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration

洋蔥多糖的收率和純度都隨著酶濃度的增加先升高后降低，當酶濃度0.4%時收率和純度最高。這可能是因為酶濃度較低時，洋蔥酶解不充分，多糖收率、純度較低；而酶用量較高時，洋蔥多糖中的某些多糖會被過量的酶分解[7，13]，部分纖維素被纖維素酶分解成可以溶于水的小分子碎片，從而導致洋蔥多糖的得率和純度下降。綜合收率和純度來看，洋蔥多糖提取的最佳酶濃度0.4%，此時洋蔥多糖收率14.44%，純度60.22%。

2.3.2 pH值的影響

控制酶濃度0.4%，酶解溫度55℃，酶解時間90 min，料液比1∶40（g/mL），考察酶解pH值分別為5.0，5.5，6.0，6.5和7.0時對洋蔥多糖的收率和純度的影響，如圖2所示。

圖2 pH值的影響Fig.2 Effect of pH

結果表明：洋蔥多糖的收率和純度隨著pH值的增大先升高后降低，在pH6.0時得到最大值。每種酶都有最適pH值，在該pH值下催化反應的速率最高[13]。幾種酶在微酸性條件下，活性較佳，最佳pH6.0，此時洋蔥多糖收率12.46%，純度60.91%。

2.3.3 料液比的影響

控制pH值6.0，酶濃度0.4%，酶解溫度55℃，酶解時間90 min，考察酶解時料液比分別為1∶20、1∶25、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）時料液比對洋蔥多糖的收率和純度的影響，如圖3所示。

結果表明：洋蔥多糖的收率隨著料液比的增大先升高后降低，在料液比1∶40（g/mL）時得到最大值，洋蔥多糖的純度隨著料液比的增大而逐漸減小。隨著提取液體積增加，有利于多糖擴散，但增加到一定量后，酶濃度低于最佳濃度，使多糖收率、純度降低。最佳料液比1∶40（g/mL），此時洋蔥多糖收率12.60%，純度66.60%。

2.3.4 酶解時間的影響

控制pH值6.0，酶濃度0.4%，酶解溫度55℃，料液比 1 ∶40（g/mL），考察酶解時間分別為 60、90、120、150、180 min時對洋蔥多糖的收率和純度的影響。圖4為酶解時間對洋蔥多糖的收率和純度的影響。

圖3 料液比的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio

圖4 酶解時間的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time

洋蔥多糖的收率隨著酶解時間的增加先下降后逐漸升高，而純度則是隨著酶解時間的增加逐漸降低。隨著酶解時間的延長，酶解作用越完全，但是時間過長會導致部分洋蔥多糖分解而使得純度降低。綜合收率和純度來看，酶解時間選擇60 min，此時洋蔥多糖收率15.69%，純度76.26%。

2.3.5 酶解溫度的影響

控制pH值6.0，酶濃度0.4%，酶解時間60 min，料液比1∶40（g/mL），考察酶解溫度分別為45、50、55、60、65℃時對洋蔥多糖的收率和純度的影響。圖5為酶解溫度對洋蔥多糖收率和純度的影響。

由圖5可知：洋蔥多糖的純度隨著溫度的升高先逐漸升高而后逐漸下降，而收率在55℃前變化不明顯。因為溫度對酶解反應和分子擴散都有影響：在溫度較低時，升高溫度既可使酶和多糖活性物質運動速度提高，有利于擴散，還能提供酶解反應所需能量，促進酶解反應，使酶解作用加強[13]，洋蔥多糖純度增加；當溫度高于酶解最佳溫度，酶的活性下降，且可能有部分多糖分解[11]，造成洋蔥多糖的純度降低。綜合收率和純度來看，洋蔥多糖的最佳酶解溫度55℃，此時洋蔥多糖收率19.13%，純度76.83%。

圖5 酶解溫度的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature

2.4 正交試驗

選擇酶解時間、酶濃度、酶解溫度、pH值、料液比5個因素進行正交試驗，研究不同因素間的交叉影響，試驗結果和極差分析結果見表2。

表2 正交試驗結果分析Table 2 Result analysis of orthogonal experimental

通過正交試驗結果的極差分析（表2）判斷復合酶提取洋蔥多糖中各單因素對多糖收率和純度影響的重要性。由表2可知影響洋蔥多糖收率的重要性為：B（酶濃度）＞C（酶解溫度）＞A（酶解時間）＞E（料液比）＞D（pH值）。洋蔥多糖收率的最優組合為A3B4C2D3E4，即最佳組合條件為復合酶用量為0.5%，酶解時間為75 min，酶解溫度為50℃，緩沖溶液pH為6.0，料液比為 1 ∶45（g/mL）；影響洋蔥多糖純度的重要性為：D（pH值）＞B（酶濃度）＞A（酶解時間）＞C（酶解溫度）＞E（料液比）。洋蔥多糖收率的最優組合為A1B2C1D3E4，即最佳組合條件為復合酶用量為0.3%，酶解時間為45min，酶解溫度為45℃，緩沖溶液pH值為6.0，料液比為1∶45（g/mL）。綜合考慮提取成本，復合酶提取洋蔥多糖的最佳試驗條件選擇復合酶用量為0.3%，酶解時間為75 min，酶解溫度為50℃，緩沖溶液pH值為6.0，料液比為 1∶35（g/mL）。

2.5 驗證試驗

準確稱取3份10.00 g洋蔥粉末，在最佳工藝條件下提取洋蔥多糖，并分析其純度，得出收率為18.75%（2.00 g洋蔥粉末收率為15.24%略高于正交試驗結果），標準偏差（SD）為 0.003 74，相對標準偏差（RSD）為1.99%；純度達62.00%，SD為0.020 5，RSD為1.89%。收率高于正交試驗結果，偏差小，說明該工藝是最佳工藝，并且此工藝重現性好，工藝穩定性高。

3 結論

本試驗以纖維素酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶按質量比2∶2∶1混合作為復合酶，通過單因素試驗與正交試驗優化復合酶提取洋蔥多糖的工藝條件，確定復合酶提取洋蔥多糖最佳工藝：復合酶用量0.3%，酶解溫度50℃，酶解時間75 min，緩沖溶液pH 6.0，料液比1∶35（g/mL）時，多糖收率18.75%，純度達62.00%。采用復合酶提取洋蔥多糖，可以進一步提高洋蔥多糖的收率和純度，并省略Sewage法脫蛋白，簡化提取工藝，且此提取工藝重現性好、穩定性高。用本方法制備的多糖沒有進一步純化，通過純化提高純度，活性將更強，應用前景將更廣闊。