微波輔助提取山竹殼中的總黃酮及其體外抗氧化活性研究

姚新鼎，姜飛燕，王玉偉，袁岐山

（1.黃河水利職業技術學院環境與化學工程系，河南開封475004；2.開封市綠色涂層材料重點實驗室，河南開封475004；3.河南中煙工業有限責任公司，河南鄭州450000）

山竹學名莽吉柿，雙子葉植物，具有極高的藥用價值。山竹中的成分對多種病癥效果顯著，如腹痛、腹瀉、感染性創傷、慢性潰瘍等疾病的治療。山竹不但具備抗氧化能力，也有助增進免疫系統健康[1]。

總黃酮提取方法有雙水相提取法、大孔樹脂吸附法、半仿生提取法、超聲提取法、微波輔助提取法等[2]。雙水相提取法分相快，易操作，提取率高，但成本較高[3-4]；大孔樹脂吸附法選擇性好，吸附速度快，但操作復雜，工藝要求較高[5-6]；半仿生提取法生產周期短，成本低，但提取效果較差[7-8]；超聲法提取操作簡單、速度快、消耗小，但總黃酮提取純度較低[9-10]；微波輔助提取法具有操作時間短、消耗少、效率高、污染小等特點[11-12]。因此本試驗利用微波輔助法探討山竹殼中總黃酮的提取工藝，為山竹的進一步研究提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山竹：廣西省玉林市；氫氧化鈉（分析純）：上海德榜化工有限公司；硝酸鋁（分析純）：廊坊市鵬彩精細化工有限公司；過氧化氫（分析純）：德州潤昕實驗儀器有限公司；硫酸亞鐵（分析純）：北京康普匯維科技有限公司；無水乙醇（分析純）：杭州富強化工有限公司；蘆丁標準品（色譜純）：中國藥品生物制品鑒定所本試驗所；1，1-二基-2-苦基肼自由基（DPPH）（分析純）：蘇州亞科科技股份有限公司。

1.2 樣品預處理

將山竹殼洗凈、風干后切成片狀，放在烘箱中干燥至質量恒定，研磨并過篩，置于棕色瓶備用。

1.3 儀器與設備

DHG-9070B型電熱鼓風干燥箱：山東博科生物產業有限公司；FW-400A型高速萬能粉碎機：上海滬粵明科學儀器有限公司；SECURA 1103-1CEU大量程精密天平：廣州市深華生物有限公司；XO-SM100型超聲微波組合反應系統：南京先歐儀器制造有限公司；KL05RF低速離心機：重慶譽嶺科技有限公司；DL-1209型紫外可見分光光度計：廈門德量檢測儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 微波輔助提取

參照崔鵬等[13-15]的方法，取適量的樣品，加入乙醇溶解后靜置20 min，在適當功率和提取時間下，制得待測液。進行多次平行試驗，取算術平均值。

1.4.2 蘆丁標準溶液的制備與標線的繪制

準確稱取蘆丁標準品0.020 0 g，用少量30%的乙醇溶解，轉移定容至100 mL容量瓶，溶液濃度為0.20 mg/mL。標線的繪制：用移液管分別移取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 的蘆丁標準溶液于 10 mL 的比色管中，依次加入適量體積的亞硝酸鈉、亞硝酸鋁、氫氧化鈉溶液，并用30%的乙醇定容，搖勻后靜置20 min。測定（505 nm）吸光度值。山竹殼中總黃酮質量濃度計算公式如下：

式中：Y為樣品中總黃酮提取率，mg/g；C為山竹殼中總黃酮類化合物的質量濃度，mg/mL；V1為稀釋體積，mL；V2為樣品溶液體積，mL；m 為樣品質量，mg；V3為取樣體積，mL。

1.4.3 標準曲線

橫坐標（X）為蘆丁質量濃度，縱坐標（Y）為吸光度值，繪制蘆丁標線如圖1所示。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The standard curve of rutin

由圖1可知，蘆丁標線為Y=9.324 3X+0.000 6，相關系數為R2=0.999 6。該標線在0～0.01 mg/mL范圍內呈良好線性關系。

1.4.4 山竹殼中總黃酮的提取單因素試驗

分別以液料比、乙醇體積分數、微波提取時間、微波功率為影響因素，設置4個因素的不同水平，分析不同提取條件對山竹殼中總黃酮提取率的影響。

1.4.5 正交優化試驗設計

根據單因素試驗結果，設計四因素四水平正交試驗，水平因素表見表1。

表1 水平因素表Table 1 Table of levels and factors

2 山竹殼中總黃酮抗氧化試驗

2.1 超氧陰離子自由基的清除

參照林海祿等[16-17]方法，測定超氧陰離子自由基清除率。取不同體積分數樣品液1.00 mL，各加入4.50 mL Tris-HCl緩沖液和0.10 mL鄰苯三酚，反應5 min后加入1.00 mL HCl溶液終止反應，混勻，以蒸餾水作參比，測定（299 nm）吸光度值。超氧陰離子自由基清除率公式為：

式中：A1為樣品液和含鄰苯三酚溶液的吸光度值；A2為不含鄰苯三酚溶液樣品液的吸光度值；A3為含鄰苯三酚溶液的吸光度值。

2.2 DPPH自由基的去除

參照孫建華等[18-21]方法，采用DPPH自由基測定山竹殼的抗氧化效果。配制濃度是0.20 mg/mL DPPH溶液，低溫陰涼處保存。取不同濃度的樣品2.00 mL，加入DPPH溶液，混勻，在暗處反應30 min左右。以無水乙醇做參比，測定（515 nm）吸光度值。去除率公式為：

式中：Ai為DPPH溶液吸光度值；Ax為樣品液和DPPH溶液吸光度值；Ae為不含DPPH溶液時樣品液吸光度值。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果分析

參照王彥平等[22]方法，采用origin8.0軟件對試驗數據制圖，單因素試驗結果進行分析。

3.1.1 液料比對山竹殼中總黃酮提取率的影響

液料比對山竹殼中總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 液料比對山竹殼中總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of liquid ratio on the extraction rate of flavonoids in Mangosteen

由圖 2 知，液料比在 30∶1（mL/g）之前，30∶1（mL/g）之后隨提取率的上升而下降。液料比為30∶1（mL/g）時，提取率最高。推測可能是樣品吸水充分溶脹，與溶劑的接觸面積增加，導致總黃酮的提取率有所上升。因此，液料比選擇 30∶1（mL/g）。

3.1.2 乙醇體積分數對山竹殼中總黃酮提取率的影響

乙醇體積分數對山竹殼中總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分數對山竹殼中總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of concentration of ethanol on the extraction rate of flavonoids in Mangosteen

由圖3知，提取率隨乙醇體積分數的增大而先上升后下降，當乙醇體積分數為75%時，提取率最高，提取率降低的原因可能是乙醇體積分數過高，不利于總黃酮類物質的溶解。此外，當乙醇體積分數過高時，會溶出醇溶性的雜質、色素和脂類物質影響總黃酮的提取率。因此，乙醇體積分數選擇75%。

3.1.3 微波提取時間對山竹殼中總黃酮提取率的影響

微波輔助提取時間對山竹殼中總黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 微波輔助提取時間對山竹殼中總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction assisted extraction of flavonoids in Mangosteen extract time

由圖4知，提取率隨提取時間的增加而先上升后下降，提取率在3 min時達到最高，提取率下降的原因是時間的增加，使溫度升高，導致乙醇揮發較快。因此，提取時間選擇3 min。

3.1.4 微波功率對山竹殼中總黃酮提取率的影響

微波功率對山竹殼中總黃酮提取率的影響見圖5。

圖5 微波功率對山竹殼中總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction power on the extraction of flavonoids in Mangosteen

由圖5知，提取率隨微波功率增加而先上升后下降，當微波功率為300 W時，提取率最高，提取率下降的原因可能是乙醇揮發較快，山竹殼中總黃酮物質不能充分被溶解。因此，微波功率選擇300 W。

3.2 山竹殼中黃酮提取條件優化正交試驗結果

正交試驗結果見表2。

表2 山竹殼中總黃酮提取條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Optimization results of orthogonal test and analysis of extraction conditions of flavonoids in Mangosteen

試驗結果顯示，總黃酮的提取率受各因素的影響次序：乙醇體積分數（A）＞微波功率（D）＞微波提取時間（B）＞液料比（C）。最佳方案是A1D2C3B2，即乙醇體積分數 75%，微波提取時間 3 min，液料比 35 ∶1（mL/g），微波功率300 W。該試驗條件沒有出現在正交試驗中，需要進行驗證，依照上述試驗條件平行3次試驗，取算數平均值結果如下：提取率分別是12.05%、12.10%、11.92%，得出山竹殼中總黃酮類物質提取率為12.02%，與正交試驗相符合。因此為最佳試驗條件，說明此方案可實施性較強。

3.3 抗氧化試驗結果

3.3.1 超氧陰離子自由基的清除

考察山竹殼中總黃酮類物質對超氧陰離子自由基的去除能力，當提取液質量濃度在4.00 mg/mL時自由基的去除率最高達到72.34%，證明山竹殼總黃酮類物質具有較好的抗氧化性。

3.3.2 DPPH自由基的去除

考察山竹殼中總黃酮類物質對DPPH自由基的去除能力，當提取液質量濃度在10.00 mg/mL時自由基的去除率最高達到68.52%，也證明了山竹殼中總黃酮類物質具有較好的抗氧化性。

4 結論

1）用微波法提取山竹殼中的總黃酮，最佳試驗條件：乙醇體積分數 75%、液料比 35 ∶1（mL/g）、微波提取時間3 min，微波功率300 W，此條件下，總黃酮提取率算數平均值為12.02 mg/g。

2）研究發現山竹殼總黃酮提取液對超氧陰離子自由基清除率最高達到72.34%，對DPPH自由基清除率最高達到68.52%，證明該提取物具有較強的抗氧化能力。