熔解曲線結(jié)合RT-PCR在餐飲食品中對(duì)5種致病菌的檢測(cè)

（嘉興市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，浙江嘉興314050）

近年來(lái)，以門店形式現(xiàn)制現(xiàn)售的食品越來(lái)越受到年輕人的喜愛(ài)，包括外賣、飲料、甜品等。但是，由于現(xiàn)制食品涉及到的原料新鮮度、保存條件及現(xiàn)場(chǎng)制作的環(huán)境、保藏條件、保存時(shí)間及人員操作等均對(duì)最終產(chǎn)品具有潛在的病原微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。該類食品現(xiàn)制現(xiàn)售、流通較快，對(duì)微生物檢驗(yàn)數(shù)據(jù)出具的時(shí)間要求較為緊迫。目前，對(duì)于食品中微生物檢測(cè)主要采用GB 4789系列標(biāo)準(zhǔn)，而且我國(guó)尚未對(duì)現(xiàn)制現(xiàn)售食品發(fā)布相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，采用傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法，步驟涉及分離、純化、生化鑒定等，方法上顯得冗長(zhǎng)，時(shí)間上顯得滯后，不利于安全監(jiān)管，也不利于應(yīng)對(duì)大型集會(huì)及突發(fā)性食品安全事件。

目前，檢測(cè)微生物的方法主要有常規(guī)培養(yǎng)法、核酸探針?lè)ā⒕酆厦告湻磻?yīng)法（polymerase chain reaction，PCR）、酶聯(lián)免疫分析法、單克隆抗體檢測(cè)技術(shù)、免疫磁珠富集技術(shù)、快速測(cè)試片法、免疫磁球法、基因芯片法等[1-2]，而其中的PCR技術(shù)在微生物檢測(cè)方面近年來(lái)得到廣泛應(yīng)用，這使得病原微生物的快速檢測(cè)得以實(shí)現(xiàn)。

研究人員利用PCR技術(shù)進(jìn)行單重病原微生物檢測(cè)，如用PCR擴(kuò)增沙門氏菌的hilA基因快速檢測(cè)沙門氏菌[3]；用PCR技術(shù)能檢測(cè)牡蠣中1 CFU/g～10 CFU/g的沙門氏菌[4]、雞皮中自帶空腸彎曲菌[5]檢測(cè)、通過(guò)擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的nuc基因，可以從牛奶中檢測(cè)出金葡菌[6]、采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）方法檢測(cè)大腸桿菌 O157：H7[7]等。利用多重PCR技術(shù)的檢測(cè)也有廣泛應(yīng)用，利用基因芯片實(shí)現(xiàn)肉中常見(jiàn)食源性致病菌的多重檢測(cè)，方法準(zhǔn)確、快速、高敏感性[8]；以沙門氏菌（invA）、單增李斯特菌（hlyA）、金黃色葡萄球菌（nuc）和腸出血性大腸桿菌O157：H7（rfbE）為靶基因設(shè)計(jì)引物，研究多重檢測(cè)致病菌的檢測(cè)方法[9-13]；利用多重?zé)晒舛縋CR-探針?lè)z測(cè)高致病性沙門氏菌血清型[14]等。

在我國(guó)，根據(jù)GB 29921-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》的要求，食品檢測(cè)的主要致病菌為沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157：H7和副溶血性弧菌。目前，利用PCR技術(shù)結(jié)合高分辨率熔解曲線的檢測(cè)方法針對(duì)該5種致病菌報(bào)道較少，因此，試驗(yàn)以該5種致病菌為研究對(duì)象，以門店現(xiàn)制現(xiàn)售的果蔬飲料為基質(zhì)，結(jié)合病原微生物增菌時(shí)間，建立快速檢測(cè)餐飲食品中5種致病菌的方法體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

采用的菌株均采購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（American Type Conservation Center，ATCC），詳見(jiàn)表 1。

1.1.2 主要試劑

緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；熒光定量PCR預(yù)混試劑SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）：寶生物工程（大連）有限公司。

表1 菌株名稱及編號(hào)Table 1 Name and number of the bacteria

1.1.3 引物

查閱標(biāo)準(zhǔn)，參考SN/T 1689-2007《食品中多種致病菌快速檢測(cè)方法PCR法》標(biāo)準(zhǔn)中列出的引物序列，見(jiàn)表2，所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 目標(biāo)菌的引物序列Table 2 Primers of 5 pathogenic bacteria

1.1.4 主要儀器

熒光定量PCR儀（LightCycler 480-Ⅱ）：羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；干式恒溫器（MK-10）：杭州奧盛儀器有限公司；快速混勻器（XK96-A）：江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；冷凍離心機(jī)（Legend Micro 21R）、超微量核酸測(cè)定儀（NanoDrop OneC）：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；生化培養(yǎng)箱（SPX-400-Ⅱ）：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 致病菌梯度培養(yǎng)

在BPW培養(yǎng)液中分別接種5種致病菌，并按照每降低10倍配制細(xì)菌稀釋液，將各梯度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。并將各梯度細(xì)菌稀釋液置36℃溫度下增菌培養(yǎng)，每隔1 h取混勻的增菌液1 mL，提取DNA，進(jìn)行檢測(cè)分析，旨在獲取各目標(biāo)菌的最短增菌時(shí)間，以達(dá)到縮短檢測(cè)時(shí)間的目的。

表3 各稀釋梯度平板計(jì)數(shù)的菌含量Table 3 The content of 5 pathogenic bacteria in different dilution （CFU/mL）

1.2.2 DNA模板提取

將目標(biāo)菌接種于果蔬飲料中，振蕩渦旋后取樣提取目標(biāo)菌DNA。取1 mL樣液加入到1.5 mL滅菌離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清液；隨后加入50 μL滅菌蒸餾水，并用快速混勻器混勻，放入100℃干式恒溫器中裂解10 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液于另一滅菌離心管中，該溶液即為DNA提取液。吸取上清液時(shí)不能吸到底部沉淀物，測(cè)定DNA模板濃度及純度。

1.2.3 RT-PCR體系的建立

根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒說(shuō)明書(shū)，配置20 μL的PCR反應(yīng)體系，其中包含10 μLSYBRPremixEXTaq（TliRNaseHPlus）（2×），0.4 μL上游引物（10 μmol/L），0.4 μL 下游引物（10 μmol/L），2 μL DNA（樣品以目標(biāo)菌DNA為模板，對(duì)照以無(wú)菌去離子水的模板）。

反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；以95℃變性5 s，58℃退火30 s，72℃延生10 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物隨后進(jìn)行熔解曲線分析，熔解程序?yàn)椋?5℃5 s，60℃1 min；然后升溫至95℃（熔解速率為0.11℃/s），最后50℃冷卻。

1.2.4 RT-PCR反應(yīng)特異性

在RT-PCR反應(yīng)體系建立的基礎(chǔ)上，分別對(duì)表1所示的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157：H7及副溶血性弧菌，進(jìn)行了特異性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR體系的建立

在RT-PCR反應(yīng)時(shí)，針對(duì)以上5種目標(biāo)菌特異性引物的退火溫度，在55℃～65℃范圍內(nèi)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果表明，5種目標(biāo)致病菌在退火溫度為58℃時(shí)均能夠獲得良好的擴(kuò)增，且非特異性擴(kuò)增不明顯，因此PCR試驗(yàn)選擇58℃作為反應(yīng)程序的退火溫度，各目標(biāo)菌梯度稀釋液的熔解曲線峰見(jiàn)圖1～圖5，并計(jì)算平均Tm值。

圖1 沙門氏菌的熔解曲線峰Fig.1 The melting curve of Salmonella

由圖1～圖5可知，沙門氏菌的Tm值為87.32℃，金黃色葡萄球菌為79.57℃，大腸埃希氏菌O157：H7為82.24℃，副溶血性弧菌為87.15℃，單核增生李斯特氏菌為82.02℃?？梢?jiàn)，5種目標(biāo)菌的Tm值部分有一定的相似性，尤其是沙門氏菌和副溶血性弧菌，大腸埃希氏菌O157：H7和單核增生李斯特氏菌，重合性較高，在多重RT-PCR反應(yīng)時(shí)可能存在相互影響難以區(qū)分。通過(guò)進(jìn)一步試驗(yàn)也證明了這點(diǎn)，試驗(yàn)將單重體系中的模板稀釋至相似濃度后，直接混合在一起進(jìn)行多重RT-PCR反應(yīng)，熔解曲線重合度較高，不能有效檢測(cè)。因此，本試驗(yàn)采用相同的RT-PCR檢測(cè)體系對(duì)5種目標(biāo)菌分別進(jìn)行檢測(cè)。

圖2 金黃色葡萄球菌的熔解曲線峰Fig.2 The melting curve of Staphylococcus aureus

圖3 大腸埃希氏菌O157：H7的熔解曲線峰Fig.3 The melting curve of Escherichia coli O157：H7

圖4 副溶血性弧菌的熔解曲線峰Fig.4 The melting curve of Vibrio Parahemolyticus

圖5 單核增生李斯特氏菌的熔解曲線峰Fig.5 The melting curve of Listeria monocytogenes

2.2 致病菌增菌時(shí)間

通過(guò)對(duì)5種致病菌梯度稀釋液的培養(yǎng)，找到5種致病菌平板計(jì)數(shù)為個(gè)位數(shù)、且經(jīng)培養(yǎng)后采用RT-PCR體系檢測(cè)均達(dá)到陽(yáng)性的最短增菌時(shí)間，見(jiàn)表4。

表4 5種目標(biāo)菌達(dá)到檢測(cè)靈敏度時(shí)的增菌時(shí)間Table 4 The enrich time of 5 pathogenic bacteria

由表4可知，沙門氏菌、副溶血性弧菌增菌2 h后，即能被檢出，而其余3種菌培養(yǎng)7 h～8 h后，也能被檢出?？梢?jiàn)，不同的菌其生長(zhǎng)率各不相同，在檢測(cè)1種菌時(shí)，可針對(duì)性地選擇合適的培養(yǎng)時(shí)間，以達(dá)到提高檢測(cè)效率的目的；而在對(duì)5種目標(biāo)菌進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)時(shí)，樣品增菌8 h后進(jìn)行檢測(cè)，能達(dá)到或超過(guò)檢測(cè)靈敏度而被檢出。

2.3 RT-PCR反應(yīng)靈敏度

隨著菌液稀釋梯度的不斷增加，其Ct值相應(yīng)增大。通過(guò)對(duì)5種致病菌的梯度檢測(cè)，結(jié)合平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，該方法對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)靈敏度為8.0×10CFU/mL，金黃色葡萄球菌為2.4×103CFU/mL，單核增生李斯特氏菌為1.3×103CFU/mL，大腸埃希氏菌O157：H7為2.2×103CFU/mL，副溶血性弧菌為 7.4×10 CFU/mL。其平均Ct值范圍在31.04～34.86之間。試驗(yàn)結(jié)果表明，上述RT-PCR反應(yīng)體系對(duì)該5種目標(biāo)菌的檢測(cè)均具有良好的靈敏度。

2.4 RT-PCR反應(yīng)體系中引物的特異性

本試驗(yàn)的反應(yīng)體系中，混合5種致病菌的DNA模板，分別對(duì)5組引物進(jìn)行特異性試驗(yàn)，5種目標(biāo)菌的擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖6，熔解曲線峰見(jiàn)圖7。

圖6 5種目標(biāo)菌Real-time PCR擴(kuò)增圖譜Fig.6 The Real-time PCR curve of 5 pathogenic bacteria

由圖6、圖7可知，5種目標(biāo)菌擴(kuò)增效果較好，Tm值分別為沙門氏菌87.48℃，金黃色葡萄球菌79.47℃，單核增生李斯特氏菌81.68℃，大腸埃希氏菌O157：H7 82.04℃，副溶血性弧菌87.09℃，與2.1試驗(yàn)結(jié)果一致，標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在0.04℃～0.14℃之間，該反應(yīng)體系中各引物對(duì)具有較好的特異性。

圖7 5種目標(biāo)菌的熔解曲線峰Fig.7 The melting curve of 5 pathogenic bacteria

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了熔解曲線結(jié)合RT-PCR快速檢測(cè)食品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157：H7及副溶血性弧菌5種致病菌的方法體系。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間的比較，分別獲得5個(gè)目標(biāo)菌達(dá)到檢測(cè)靈敏度的最短增菌時(shí)間，增菌時(shí)間范圍為2h～8h，試驗(yàn)靈敏度分別為沙門氏菌8.0×10CFU/mL，金黃色葡萄球菌2.4×103CFU/mL，單核增生李斯特氏菌1.3×103CFU/mL，大腸埃希氏菌O157：H7為2.2×103CFU/mL，副溶血性弧菌7.4×10 CFU/mL。5種目標(biāo)菌的Tm值分別為沙門氏菌87.32℃，金黃色葡萄球菌79.57℃、單核增生李斯特氏菌82.02℃、大腸埃希氏菌O157：H782.24℃、副溶血性弧菌87.15℃。試驗(yàn)采用水煮法[15]直接提取樣品中的DNA，其操作簡(jiǎn)單，提取時(shí)間短，DNA純度范圍在1.4～1.8之間，能滿足PCR檢測(cè)要求。通過(guò)該方法體系的建立，針對(duì)以上5種致病菌，檢驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單方便，與常規(guī)微生物檢測(cè)方法比較，大大提高了檢測(cè)時(shí)效性，且該方法的靈敏度、特異性均滿足要求，為實(shí)現(xiàn)餐飲食品中微生物的快速檢測(cè)提供參考。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于不同致病菌的生長(zhǎng)速率不同，在增菌時(shí)間上各有差異，檢測(cè)時(shí)可根據(jù)具體檢測(cè)目標(biāo)菌選擇不同的增菌時(shí)間，以縮短檢驗(yàn)時(shí)間。反應(yīng)體系建立時(shí)，退火溫度是關(guān)鍵條件，要根據(jù)目標(biāo)菌引物的特性調(diào)整退火溫度，使得在相同退火溫度等PCR參數(shù)條件下實(shí)現(xiàn)同步檢測(cè)的目的。另外，簡(jiǎn)單地把模板DNA和引物混合起來(lái)，由于DNA和引物對(duì)之間的相互影響，利用熔解曲線檢測(cè)效果并不理想。但試驗(yàn)建立的反應(yīng)體系，在僅混合DNA模板而不混合引物時(shí)，同時(shí)檢測(cè)5種目標(biāo)菌，具有較好的擴(kuò)增曲線，且引物對(duì)的特異性也較好。