微滴數字PCR定量檢測乳制品中單核細胞增生李斯特氏菌

程逸宇，馮秋實，吳海晶，黃夢靜，劉新梅

（南京市食品藥品監督檢驗院，南京211198）

0 引 言

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria.monocytohenes）是一種常見的食源性致病菌[1-2]。世界衛生組織指出，單核細胞增生李斯特氏菌可能污染蔬菜、乳制品、肉制品等常見食品[3]，特別在乳制品中普遍存在[4]。我國對食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢測采用培養法[5]，檢驗周期較長，需要6～7 d才能完成，不能滿足乳制品中單核細胞增生李斯特氏菌快速檢測的需求[6]。微滴數字PCR(Droplet digital PCR，dd PCR)是新型核酸定量檢測技術[7]。該方法在PCR前將含有核酸的反應體系進行微滴化處理，使大部分微滴中的DNA分子數為1或0，依據泊松分布計算出樣本中的DNA分子數[8]，實現核酸絕對定量分析[9]。建立單核細胞增生李斯特氏菌dd PCR檢測方法，對乳制品中單核細胞增生李斯特氏菌的快速定量檢測具有重大意義。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株

單核細胞增生李斯特氏菌（ATCC19115）、大腸埃希氏菌（ATCC25922）、英諾克李斯特氏菌（CICC21671）、伊氏李斯特氏菌（CICC21663）、斯氏李斯特氏菌（CICC10417）。

1.1.2 材料與試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒、qPCR擴增預混液Premix Ex Taq(Takara)；dd PCR擴增預混液dd PCR Super mix for Probes（Bio-Rad）；引物、探針；單核細胞增生李斯特氏菌顯色培養基；TSA-YE培養基、營養肉湯。

1.1.3 儀器與設備

生化培養箱，QX 200微滴式數字PCR系統，T 100 PCR儀，CFX 96 Touch熒光PCR儀，冷凍高速離心機。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養

用接種環沾取甘油管保存的單核細胞增生李斯特氏菌(ATCC 19115)標準菌株菌液，在胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSA-YE)平板上劃線，于37°C培養16 h。挑取單菌落接種于營養肉湯液體培養基，37°C培養至對數生長期備用，采用GB4789.30-2016平板計數法[10]檢測菌液濃度。

1.2.2 細菌DNA提取及引物和探針設計

取體積為1 mL菌液，采取Takara細菌DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA，洗脫到100μL TE緩沖液中。參考SN/T 1870-2016[11]，以單核細胞增生李斯特氏菌iap基因為靶基因，合成引物探針，如表1。1

表1單核細胞增生李斯特氏菌PCR引物和探針序列

1.2.3 qPCR和dd PCR反應體系及反應條件

qPCR反應體系(25μL)：12.5μL buffer；濃度為10μmol/L上、下游引物各1μL；濃度為10μmol/L探針0.5μL；模板DNA 1μL；用ddH 2O補至25μL。qPCR反應條件為95°C，3 min；94°C，5 s，60°C，40 s(收集FAM熒光)，40個循環。

dd PCR反應體系：上、下游引物各1.8μL（濃度900 nmol/L），探針0.5μL（濃度250 nmol/L），dd PCR Super mix for Probes 10μL，DNA模板1μL，加dd H 2O至20μL。利用Bio-Rad QX 100數字PCR微滴生成儀將20μL體系混合物生成微滴，再利用Bio-Rad T100 PCR儀進行擴增。dd PCR反應條件為：95℃預變性10 min，94℃變性30 s，60℃退火1 min，40個循環，98℃微滴固化10 min后，4℃保存。PCR反應結束后利用Bio-Rad QX 200微滴分析儀讀取DNA拷貝數。

1.2.4 dd PCR檢測方法特異性驗證

分別挑取單核細胞增生李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、大腸埃希氏菌至營養肉湯中，37°C培養16 h，提取DNA，采用

1.2.3 條件進行dd PCR檢測。

1.2.5 dd PCR和qPCR檢測方法線性范圍

將1.2.2制得的單核細胞增生李斯特氏菌DNA提取液進行10倍梯度稀釋，得到終濃度分別為107，106，105，104，103，102，10，1拷貝數/mL的樣品，標記為S7-S0。樣品取1μL作為模板DNA進行dd PCR和qPCR檢測，每個梯度做3次平行檢測。

1.2.6 人工污染巴氏乳檢測

選取市售巴氏乳，加入1.2.1培養的單核細胞增生李斯特氏菌菌液，梯度稀釋，制得含菌量為5×107，5×106，5×105，5×104，5×103，5×102，50 mL-1的人工污染巴氏乳樣品。提取樣品中細菌DNA，采用qPCR法和dd PCR法分別進行檢測，每一樣品進行三次重復，比較兩種檢測方法的檢出限（LOD）、定量限（LOQ）及可重復性。

2 結果與分析

2.1 dd PCR檢測方法特異性

dd PCR對單核細胞增生李斯特氏菌DNA擴增的實驗結果如圖1所示。DNA擴增效果良好，其中陽性微滴和陰性微滴明顯分成兩簇(圖1a)，而且中間彌散的微滴數目很少；直方圖(圖1b)中陽性峰和陰性峰顯著分開，中間沒有任何干擾，表明ddPCR引物探針和

擴增體系適合對單增李斯特氏菌進行定量分析。

圖1 ddPCR方法擴增單核細胞增生李斯特氏菌DNA擴增實驗結果

采用李斯特氏菌屬4種菌株（單核細胞增生李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌）和常見菌大腸埃希氏菌進行dd PCR檢測方法特異性驗證。只有單核細胞增生李斯特氏菌得到特異性擴增，其他菌株均為陰性反應，無特異性擴增，如圖2，表明單核細胞增生李斯特氏菌dd PCR檢測方法具有良好的特異性。

圖2 ddPC檢測單核細胞增生李斯特氏菌方法特異性實驗

2.2 dd PCR和qPCR檢測方法線性范圍

將單核細胞增生李斯特氏菌DNA提取液梯度稀釋，制得DNA濃度為107～1拷貝數copies/mL的樣品，標記為S7-S0，進行dd PCR和qPCR檢測。所有dd PCR反應生成的微滴數目均大于10 000，表明所有反應微滴生成正常，保證了后續定量分析的準確性。S7至S0樣品中，dd PCR產生的陽性微滴數目隨著模板DNA濃度降低而降低。在S7中，陽性微滴數與微滴總數接近，表明所有的微滴都有模板DNA分子分布，該濃度下所有微滴均被DNA飽和，無陰性微滴存在，不滿足泊松分布，定量結果顯著偏離真實值，無法實現dd PCR的準確定量。而在S0中，因模板DNA濃度過低導致沒有陽性微滴生成，檢測結果為陰性，無特異性擴增如圖3所示。實驗表明，S6-S1這6個樣品均適合dd PCR擴增，能計算出模板DNA濃度，表明dd PCR的檢測范圍是106～10拷貝數/m L，最低檢出限為10拷貝數/mL。根據檢測結果繪制標準曲線，樣品DNA濃度在106～10拷貝數/mL之間時dd PCR檢測結果呈良好的線性關系R2=0.9996，適合定量檢測的需要，如圖4。

圖3 ddPCR各樣本生成的微滴數

圖4單增李斯特氏菌ddPCR檢測標準曲線

qPCR檢測結果顯示，qPCR可對S7-S3樣品進行特異性擴增，擴增曲線正常，如圖5，而對S2，S1和S0這三個樣品無法檢出。這說明qPCR最低檢出限為103拷貝數/mL，檢測靈敏度低于dd PCR。將測得C t代入標準曲線計算濃度值作圖，qPCR線性相關系數R2=0.9980，如圖6。從實驗結果可以看出，dd PCR檢測的標準曲線相關性和最低檢出限均優于qPCR檢測，表明dd PCR和qPCR相比具有更高的準確度和靈敏度。

2.3 人工污染乳制品檢測

對不同菌量污染的巴氏乳進行dd PCR和qPCR檢測，結果如表2所示。ddPCR檢測人工染菌巴氏乳，當樣品含菌量為5×107CFU/mL時陽性液滴過飽和，無法讀出準確數值。樣品含菌量在5×103～5×106CFU/mL之間時dd PCR檢測結果與理論添加值吻合度較高。食品法典(CAC)標準規定，當檢出率≥95%時為最低檢測下限（LOD），當相對標準偏差RSD≤25%時為定量檢測下限（LOQ）[12]。三次重復實驗的統計結果顯示，樣品含菌量在5×102CFU/mL時dd PCR檢出率≥95%但RSD≤25%，因此該檢測方法的LOD和LOQ分別為5×102CFU/mL和5×103CFU/m L。qPCR檢測能對含菌量在5×107～5×103CFU/mL之間樣品進行特異性擴增，根據標準曲線計算出的結果重復性較差，且與理論添加值有較大誤差。由此可見，dd PCR檢測方法在檢測靈敏度、準確度及穩定性上均優于qPCR檢測方法。

圖5單增李斯特氏菌qPCR檢測

圖6單增李斯特氏菌qPCR檢測標準曲線

表2檢測人工污染巴氏乳中單核細胞增生李斯特氏菌

比較2.2與2.3中dd PCR檢測結果可知，dd PCR檢測巴氏乳中單核細胞增生李斯特氏菌的靈敏度遠低于直接檢測該菌DNA提取液。可能導致這一結果的原因為，細菌DNA提取試劑盒提取低濃度細菌DNA時得率較低，從而使得檢測靈敏度降低。由此可見，高效提取樣品中低濃度細菌DNA是提高dd PCR檢測方法靈敏度的關鍵。

3 結 論

乳制品是人體受單核細胞增生李斯特氏菌侵染的主要感染源，加強對乳制品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測尤其重要。目前常用的傳統培養方法操作簡單，但是耗時長，不能滿足致病菌檢測快速、靈敏的需要，不適用于大規模快速檢測。隨著檢測技術的進步，研究人員開發出實時熒光PCR法（qPCR）[13]、熒光染色法[14]、酶聯免疫法（ELISA）[15]等多種快速檢測方法。qPCR法具有方便快捷、靈敏度高[16]等優點得到廣泛應用，但也存在重復性差、無法準確定量等問題[17]。dd PCR作為一種新的定量檢測技術已廣泛運用到致病菌檢測中[18]。周巍等[19]建立了發酵乳中dd PCR技術定量檢測金黃色葡萄球菌的方法，檢測特異性良好，檢測靈敏度為3.3×101CFU/g。本研究實驗運用dd PCR技術對乳制品中的單核細胞增生李斯特氏菌進行檢測與精確定量。dd PCR方法簡便快速，具有較好的特異性，能對乳制品中單核細胞增生李斯特氏菌含量進行準確測定。ddPCR檢測方法對巴氏乳中單核細胞增生李斯特氏菌的最低檢出限（LOD）為5×102CFU/mL，定量限（LOQ）為5×103CFU/mL，滿足快速定量檢測的要求。本方法與qPCR方法相比，具有靈敏度高、精密度高、可重復性好、檢測低濃度染菌樣品更精確等優點，適合在乳制品企業及食品檢測機構中推廣運用。