小鼠諾如病毒分子生物學研究進展*

趙 娜 趙歆伊 孟 琦 邱雯賢 何 濱 馬小龍 張艷淑 姚 林, 李 爽

(1.華北理工大學實驗動物中心，唐山 063210)(2.華北理工大學基礎醫學院，唐山 063210)(3.華北理工大學公共衛生學院，唐山 063210)

實驗動物的質量與動物實驗能否順利進行關系非常密切，我國《實驗動物 微生物學等級及監測》(GB 14922.2—2011)規定無特定病原體(Specific pathogen Free，SPF)級別小鼠須排除11種病毒，但仍會因動物本身攜帶其他病原微生物而干擾實驗結果。據報道，小鼠諾如病毒(Murine Norovirus，MNV)已經成為目前實驗小鼠感染率較高的一種病毒，免疫缺陷小鼠感染后發生炎癥反應甚至死亡[1]，對科研工作危害極大[2-3]。本文就小鼠諾如病毒的分子生物學特點及其復制進行綜述。

1 小鼠諾如病毒的分子生物學特點

1.1 基因組

小鼠諾如病毒屬于嵌杯狀病毒科(Caliciviride)諾如病毒屬(Norivirus)，與人源諾如病毒(Norwalk virus，NoV)的生物學及遺傳特性相似。MNV基因組長約7.5 kb，為正義單鏈RNA，在其5′末端基因組和亞基因組RNA與病毒非結構蛋白NS5或病毒的末端結合蛋白(Viral protein genome-linked，VPg)共價連接，而3′末端為polyA結構[4]。基因組由三個開放閱讀框(Open reading frame，ORF)組成。之后有學者在ORF2內發現了ORF4，其被認為編碼毒力因子[5]。ORF1編碼6個非結構蛋白(5′-NS1-2-NS3-NS4-NS5-NS6-NS7-3′)，其翻譯成的一個多聚蛋白被蛋白酶NS6切割產生成熟的與復制相關的病毒蛋白。ORF2和ORF3分別編碼衣殼蛋白(Capsid protein，VP1和2)，VP1和VP2是組成病毒粒子的結構蛋白。ORF4編碼的毒力因子-1(Virulence factor-1，VF1)在感染小鼠中發揮重要作用，然而該蛋白在其他諾如病毒中未被發現。

1.2 病毒蛋白

1.2.1非結構蛋白

目前，MNV的許多單個蛋白的功能尚未被闡明，它們的作用通常是根據保守的基序和已知的亞細胞定位從相關的病毒和序列分析數據推斷的，但肯定的是這些蛋白質與其他正義單鏈RNA病毒編碼的蛋白質一樣為多功能蛋白質。

盡管NS1-2的功能尚不明確，但是轉染實驗表明其定位于內質網(Endoplasmic reticulum，ER)和高爾基體，可能參與了高爾基體的分解[6]。研究發現NS1-2影響細胞內相關蛋白的運輸和表達，Ettayebi和Hardy的研究證明NS1-2能夠阻止水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)G-糖蛋白在細胞表面的表達，提示NS1-2可能具有潛在的免疫逃避作用。NS1-2可通過與囊泡相關膜蛋白A(Vesicle-associated membrane protein A，VAP-A)和分泌途徑的其他組分的相互作用破壞細胞內蛋白質運輸的能力[7]。ER和高爾基體的重排被認為有助于募集宿主膜和蛋白質以促進病毒復制復合物(Replication complex，RC)的形成，有利于病毒復制[8]。在病毒感染過程中觀察到MNV NS1-2在RC內的ER和dsRNA定位，表明NS1-2是RC的重要組成部分[9]。

NS3為2C樣蛋白，與小核衣殼蛋白家族的2C蛋白具有序列同源性和相似的基序，其包括核苷三磷酸酶(NTPase)基序，因此提示NS3可具有NTPase功能。Pfister等[10]發現NS3可以在體外與三磷酸腺苷(ATP)結合，但是不具有解開合成的DNA-RNA異源雙鏈的能力，因此顯示它不具有解旋酶活性。盡管在感染期間這些結構還未被觀察到，但已經證明單獨的MNV NS3蛋白表達形成水泡狀結構并引起細胞內膜的變化[6]。

通過對NS4內部疏水性區域的預測發現，它能與膜C-末端結合，被認為是定位在ER的p30類似物[10]。與NS4類似的脊髓灰質炎病毒(Poliovirus)3 A蛋白可以通過抑制ER-高爾基細胞運輸引起免疫逃避[11]。研究發現MNV NS4轉染細胞后定位于ER和高爾基膜，且與NS5能相互作用[12]。

NS5在病毒轉錄、翻譯和衣殼化中具有重要作用。與小核糖核酸病毒(Picornavirus)和杯狀病毒科成員相似，gRNA和sgRNA都與5′端的帽結合蛋白(Cap-binding protein)類似物NS5/VPg連接[13]。NS5/VPg的消耗或抑制的研究揭示其在翻譯復合物的募集以及翻譯起始中具有主要作用，結構解析研究已經顯示VPg形成具有靈活的N端/C端的螺旋核心，這對蛋白質功能的多樣性十分重要[14]。研究顯示MNV VPg能夠結合翻譯起始因子eIF3和eIF4G1，進一步說明NS5在翻譯起始復合體中的作用[15]。

NS6是病毒編碼的半胱氨酸蛋白酶，可將ORF多聚蛋白切割成單獨的蛋白質和一些中間產物(包括NS6-7前體)。NS6和中間產物NS6-7可以優先在不同位點裂解ORF1[16]。與其他RNA蛋白酶類似，NS6以順式和反式切割多聚蛋白以產生多聚蛋白和成熟的單個NS蛋白[17]。在包括MNV在內的杯狀病毒科成員中，ORF1內的5個切割位點已被確認為保守的切割位點[9]。在病毒感染期間，NS6主要定位于RC；當單獨表達時，NS6顯示定位于線粒體[6]，其功能可能與丙型肝炎病毒(HCV)和甲型肝炎病毒(HAV)蛋白酶相似，可以通過切割線粒體抗病毒信號傳導蛋白(Mitochondrial antiviral signalling protein，MAVS)抑制抗病毒信號傳導[18]。

在大多數情況下，病毒感染細胞中NS6-NS7前體蛋白被進一步加工產生病毒RNA依賴性的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)NS7。NS7催化基因組和亞基因組的正反義RNA轉錄。NS7和NS6-7前體蛋白在復制過程中已經被證明具有生物學活性，在復制周期中的不同時間點，它們都可能發揮著更重要的作用[19]。NS7的晶體結構顯示其不同條件下可表現出不同的酶活性[20]。

1.2.2結構蛋白

VP1是病毒主要的衣殼蛋白(58～60 kDa)。VP1由N端臂，衣殼域(Shell domain，S)和突變域(Protruding domain，P)組成，形成“杯狀”結構。S和P通過一個靈活的鉸鏈區域連接。病毒粒子需要衣殼蛋白的180個分子形成38 nm的衣殼，其顯示為T=3的二十面體對稱[21]。

ORF3編碼的VP2是一種小的堿性蛋白，與病毒粒子成熟相關。VP2具有高度可變性，盡管關于其在復制中的作用知之甚少，但發現VP2在VP1表達和基因組的調節中起一定作用。研究顯示盡管VP2對VLP組裝是非必需的，但是對VLP的穩定性有一定影響。與VP1相比，VP2的翻譯速度慢且效率低，每個病毒粒子中僅存在1～2個VP2拷貝，而VP1有180個拷貝[22]。

2 小鼠諾如病毒的復制

病毒基因組復制必須借助宿主翻譯機制翻譯病毒非結構蛋白，特別是RNA依賴性RNA聚合酶(NS7)和蛋白酶(NS6)。基因組RNA作為非結構蛋白的初始翻譯模板，而結構蛋白VP1、VP2和VF1分別主要是從亞基因組RNA中翻譯[4]。

同正義單鏈RNA病毒一樣，MNV基因組復制依賴于產生的反義中間體作為正義基因組RNA的模板。正義或反義的基因組和亞基因組RNA復制的啟動具有VPg依賴性。正義基因組RNA合成是由VPg啟動通過病毒RdRp(NS7)進行合成的，VPg同時為反義模板3′末端的蛋白質引物。RdRp通過MNV中保守的酪氨酸殘基(Y26)將VPg共價結合到基因組和亞基因組RNA的負義模板鏈的起始核苷酸上[23]。亞基因組RNA與最后2.4 kb的基因組RNA相同，與VPg和ployA連接。目前認為啟動亞基因組RNA合成的機制有兩種，分別是提前終止和內部啟動。亞基因組RNA的啟動子由高度保守的莖環結構組成，位于NS7編碼區VP1的上游。Lin等[24]發現該啟動子以及一個短模板序列優先被MNV的RdRp識別，并確保能與RdRp穩定結合。MNV VPg已經被證實與翻譯復合物的組分相互作用，如eIF4F，eIF3和帽結合蛋白，其中eIF4F在VPg啟動病毒蛋白翻譯中的作用尤為重要[13]。VPg和eIF4G的C-末端之間的相互作用是高效翻譯所需要的，另外VPg和eIF4F核心組分構成的Poly A結合蛋白(Poly-(A)-binding protein，PABP)在MNV復制中發揮重要作用。

此外，位于ORF編碼區側翼的非編碼區(Untranslated regions，UTR)可能是通過與翻譯調控相關的宿主蛋白(包括La，PTB和DDX3)相互作用進行基因組RNA翻譯。研究發現當UTR與宿主細胞蛋白的相互作用被抑制時病毒復制減少。這種相互作用被認為通過促進病毒RNA環化來誘導5‘和3’末端UTR上互補序列的結合來促進病毒復制[25]。

一旦募集到宿主細胞翻譯復合物，MNV的非結構蛋白被翻譯成單個多聚蛋白，進一步被病毒蛋白酶NS6切割成單獨的NS蛋白。研究發現，MNV的蛋白酶具有保守的殘基H30和C139，這些保守的氨基酸殘基對維持蛋白酶活性必不可少。May等[26]發現NS6在不同的切割位點的切割效率不同，導致NS2-3和NS3-4的切割速率高于NS4-5，NS5-6和NS6-7。最近發現裂解位點上游的殘基P4-P2′是一個重要的切割信號，負責控制酶的效率，從而導致有偏向性的切割。病毒RdRp在內的非結構蛋白在成功翻譯和加工后，含有所有NS蛋白以及VP1和VP2的病毒RC在宿主細胞的胞質中形成。MNV RC為點狀灶，定位于微管組織中心(Microtubule organizing center，MTOC)。其中VP1與乙酰化微管蛋白共定位，表明細胞骨架可能參與細胞內RC的定位。RC與感染后形成的宿主細胞膜復合物和病毒誘導的膜囊泡相關，這些膜結構可能從宿主細胞的ER和高爾基體衍生而來，并被重新分配到RC[27]。研究發現，MNV的NS1-2和NS4在細胞中過表達時直接影響高爾基體和蛋白質分泌，兩者共定位于ER和高爾基體，表明其在宿主的膜表達及再分配中發揮一定的作用[6]。