實驗小鼠腎勻漿中肽酶-3樣本穩定性分析

王 洪 魏 杰 馮育芳 劉雅丹 項新華 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

能力驗證計劃是通過實驗室間檢測結果的比對來衡量實驗室能力的活動，是實驗室證明其檢測技術能力水平的一種手段。實驗動物質量控制是保證實驗動物質量和動物實驗可靠程度的根本手段[1]。通過開展實驗動物領域的能力驗證計劃，可以增加實驗室間的技術交流，了解各實驗室在肽酶-3項目的檢測技術水平和能力，及時發現并解決檢驗中存在的問題，促進實驗室提高檢測水平，從而推動實驗動物行業的進步。基于此，中國食品藥品檢定研究院(國家實驗動物質量檢測中心)組織實施能力驗證項目“NIFDC-PT-106 實驗小鼠腎勻漿中肽酶-3的檢測”。原有的國家標準GB/T 14927.1—2001中推薦使用了13個用于實驗大鼠和小鼠的遺傳質量評價的生化標記位點，國家標準修訂后，更正為14個生化標記位點。肽酶-3是國家標準GB/T 14927.1—2008修訂時，新增的位點。國家標準修訂后，廣泛開展肽酶-3位點檢測的實驗室并不多，有必要組織實施該項目的能力驗證活動來考察實驗室的檢測能力。

生化標記法中14個生化標記位點均為蛋白質成分，肽酶-3也不例外。肽酶-3對溫度敏感，對保存時限也有要求。作為能力驗證項目，有必要對肽酶-3樣本的穩定性進行考察。

能力驗證樣品的穩定性考察是能力驗證工作順利開展必不可少的環節，同時也是能力驗證計劃實施成敗與否的關鍵因素，更是關乎能力驗證活動結論可信度的重要條件。基于此，本研究針對影響肽酶-3穩定性的兩個主要因素：溫度和時間，進行穩定性考察，以期獲得肽酶-3樣本的保存條件和運輸條件，在項目實施過程中加以利用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物：20只SPF級8周齡雄性C57BL/6小鼠和15只SPF級8周齡雌性BABL/c小鼠，均來源于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2012-0001]。20只SPF級8周齡雌性CBA小鼠，來源于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]。按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 樣品制備

本次能力驗證項目提供的被測樣品為小鼠腎勻漿的凍干樣品。制備方法：采用頸椎脫臼法處死動物，剖腹，取小鼠腎臟，加入預冷的蒸餾水，蒸餾水與腎臟的比例為2∶1(V/W)。用組織勻漿器勻漿，然后置4 ℃低溫高速離心機中，15 000 r/min，30 min。取上清，加保護劑，分裝，每瓶裝量70 mg/瓶，用凍干機凍干。小鼠腎勻漿凍干樣品為紅色固體。加蓋，封口膜封口，封口袋包裝。采用隨機數字方式編號。貯藏條件為密封，2～8 ℃冷藏[2-4]。

1.3 穩定性檢驗

1.3.1分別將時間和溫度設為橫、縱坐標，設定-20 ℃，4℃，室溫和37℃4個溫度檢驗點，設定1、2、3、4、5、6、7、14 d和28 d為9個時間檢驗點，在每個坐標交點，每個型別的樣品分別隨機抽取1瓶進行檢驗。

1.3.2在取出日期，依據GB/T 14927.1—2008對樣品進行檢測，觀測穩定性結果。所有樣品均需加入70 μL蒸餾水還原。

1.3.3記錄各型別不穩定結果出現的時間和溫度，當不穩定點出現后，其之后的時間溫度觀測點隨之取消，37 ℃的樣本穩定性同時檢測1～6天的結果。但即使一直穩定，本測定的觀測周期也僅為28 d時長。

1.3.4匯總穩定性結果，填寫各自時間溫度穩定性結果報告單。穩定用“○”表示，不穩定用“×”表示。

1.3.5穩定性結果判定：每觀測點每型別均抽取1瓶，電泳染色。如發現任何1瓶發生條帶模糊不可讀，則認為在該點樣品的穩定性已經發生了變化，即在該時間溫度條件下該型別樣品不穩定。

注：A代表CBA樣本，B代表BALB/c樣本，C代表C57BL/6樣本
Note:A shows CBA samples,B shows BALB/c samples,C shows C57BL/6 samples

2 結果

肽酶-3樣本選用了3個品系的小鼠進行制備。共制備85份CBA樣本，82份BALB/c樣本，82份C57BL/6樣本。樣本總數為249份。

肽酶-3樣本在37 ℃觀測至第6天，該樣本僅能穩定保存1 d，在保存至第2天時，條帶模糊，無法辨認。2～6 d均為模糊條帶。在4 ℃、室溫和-20 ℃可以穩定保存至28 d。詳見表2。

表2 肽酶-3樣本的穩定性檢驗結果Table 2 Results of stability detection for PEP3 samples

如圖1所示，在室溫條件下，3個品系的3類樣本放置1 d和2d的電泳條帶，清晰可見。如圖2所示，在4 ℃條件下，3個品系的3類樣本放置3 d和4 d的電泳條帶，清晰可見。如圖3所示，在-20 ℃條件下，3個品系的3類樣本放置5 d和6d的電泳條帶，清晰可見。如圖4所示，在-20 ℃條件下，3個品系的3類樣本放置14 d和28 d的電泳條帶，清晰可見。

圖1 在室溫條件下放置1 d和2d的肽酶-3樣本電泳圖注：1：A37；2：A93；3：B40;4:B12；5:標準1(b)；6：標準2(a)；7:C46；8:C68Fig.1 Electrophoresis map of 1 day and 2 days at room temperatureNote:1：A37；2：A93；3：B40;4:B12;5:Marker1(b)；6：Marker2(a);7:C46;8:C68

圖2 在4 ℃條件下 放置3 d和4 d的肽酶-3樣本電泳圖注：1:A20；2:A99；3:B70；4：B89；5:標準1(b)；6:標準2(a)；7:標準3(a)；8:C72；9:C54Fig.2 Electrophoresis map of 3 dasy and 4 days at 4 ℃Note:1:A20；2:A99；3:B70；4：B89；5:Marker 1(b)；6:Marker 2(a)；7:Marker 3(a)；8:C72；9:C54

圖3 在-20 ℃條件下放置5～6 d的肽酶-3樣本電泳圖注：1:A27；2:A13；3:B93；4：B83；5:標準1(b)；6:標準2(a)；7:標準3(a)；8:C43；9:C74Fig.3 Electrophoresis map of 5 days and 6 days at -20 ℃Note:1:A27；2:A13；3:B93；4：B83；5:Marker 1(b)；6:Marker 2(a)；7:Marker 3(a)；8:C43；9:C74

圖4 C樣本在室溫，4 ℃，-20 ℃條件下放置14 d和28 d的肽酶-3樣本電泳圖注：1:C86；2:C92；3:C69；4：C60；5:標準1(b)；6:標準2(a)；7:標準3(a)；8:C39；9:C14Fig.4 Electrophoresis map of C sample in 14 days and 28 days at room temperature,4 ℃ and -20 ℃Note:1:C86；2:C92；3:C69；4：C60；5:Marker 1(b)；6:Marker 2(a)；7:Marker 3(a)；8:C39；9:C14

3 討論

3.1 貯存溫度

溫度升高將導致蛋白質的生物學活性喪失，酶的生物學功能失效。生化標記方法是通過生物化學方法染色來識別不同品系動物在各生化標記位點的差異。一旦酶的生物學功能喪失，將無法通過酶的不同蛋白表型將不同品系的動物區分開來。肽酶-3能力驗證活動中，各實驗室將獲得3份不同蛋白表型的樣本。因此肽酶-3樣本的穩定性尤為重要。在溫度的選擇上，考慮到能力驗證樣品在運輸，存儲和檢驗過程中可能出現的極端條件，本研究選擇了4個溫度點：37 ℃，室溫，4 ℃和-20 ℃。選擇室溫，而不是設定為25 ℃，是希望溫度條件盡量接近真實情況。北京1～2月的室溫在20 ℃左右，肽酶-3樣品可穩定保存至28 d。考慮到南北方的氣候差異，北方的室溫10 ℃，南方可能是40 ℃。所以，室溫的存放時間應因地域而異。在4 ℃和-20 ℃，肽酶-3樣本可以穩定保存至28 d。因此，在樣本制備完成到發放樣品之前，樣本應保存在-20 ℃條件下；樣本的運輸應保存在4 ℃以下的容器中；如果條件允許，最好也存放于-20 ℃條件下；接收樣本的實驗室，應在第一時間將樣本轉移至低溫冰箱。溫度是導致肽酶-3樣本不穩定的首要因素，因此，樣本的貯存和運輸必須嚴格控制溫度。

3.2 貯存時間

依據能力驗證項目的實施周期，包括運輸和檢驗的時間，可在28 d內全部完成。所以沒有進行更長期的穩定性檢驗。肽酶-3樣本在37 ℃條件下僅能穩定保存1 d，在其他3個溫度檢驗點可以穩定保存至28 d。因此，樣本應新鮮制備，如果長期存放，應進行長期穩定性考察[5-6]。接收樣本的實驗室應在接收樣品后盡快進行實驗。如果不能及時進行實驗，應在第一時間將樣本轉移至低溫冰箱保存。因為參加實驗室遍布全國各地區，對于路途較遠，交通不便的地區，樣本應區別對待，應采取更多的控溫措施，例如：保證足夠數量的干冰。樣本保存的時間越長，穩定性出現偏差的風險越大。尤其應縮短樣本在室溫的保存時間。

3.3 肽酶-3位點的特殊性

國家標準中的14個生化標記位點，對溫度的敏感程度各不相同，不同位點應采取不同的保存條件。不同位點需要分別做穩定性檢驗。肽酶-3是對溫度較為敏感的一個位點，應采取有效措施保證運輸途徑和貯存條件的低溫狀態。在能力驗證提供者認可評審以及監督評審中，樣本的穩定性檢驗都是重要的考察項[7-9]。

通過本研究發現肽酶-3樣本在室溫，4 ℃和-20 ℃，可以穩定保存至28 d，而在37 ℃僅能穩定1 d。說明肽酶-3是一類對溫度較為敏感的蛋白質。依據能力驗證樣品穩定性檢驗的數據可以為肽酶-3項目的順利實施提供技術保障。在該項目的實施過程中，有必要嚴格控制肽酶-3樣本的保存條件和運輸條件。