MuSK重癥肌無(wú)力小鼠模型的建立*

劉潺潺 李 婷

(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明)，深圳 518000)

重癥肌無(wú)力(MG)是一種神經(jīng)肌肉接頭的自身免疫性疾病，早在1973年在MG患者身上發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿受體抗體(AchR-Ab)，2001年在MG患者中才又發(fā)現(xiàn)了一種新的抗體，肌肉特異性受體酪氨酸激酶抗體(MuSK-Ab)。乙酰膽堿受體(AchR)和MuSK抗體陽(yáng)性的MG是具有獨(dú)立免疫學(xué)靶點(diǎn)的自身免疫性疾病。與神經(jīng)肌肉接頭功能障礙的機(jī)制不同，兩者臨床表現(xiàn)與治療差別很大[1]，比如MuSK MG經(jīng)常呈現(xiàn)近端肩胛肌和面部肌無(wú)力的特征性臨床表現(xiàn)，更多的肌無(wú)力危象和呼吸衰竭，長(zhǎng)期預(yù)后較差。在突觸形成過(guò)程中，MuSK能調(diào)節(jié)AchR聚集，所以MuSK能維持AchR的正常空間結(jié)構(gòu)，從而保障突觸功能。國(guó)外報(bào)道AchR抗體陰性的患者，MuSK抗體陽(yáng)性占 38%～47%左右，相當(dāng)于所有MG患者中的10%左右。MuSK-MG患者胸腺增生少見(jiàn)，胸腺瘤罕見(jiàn)，而且胸腺切除術(shù)后MuSK抗體血清保持不變，所以胸腺切除對(duì)MuSK患者療效較差，構(gòu)建MuSK-Ab小鼠模型有利于該疾病的研究[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6～8周的雌性C57BL/6小鼠,購(gòu)于華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)單位為三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(鄂)2017-0012。

1.1.2試劑：MuSK-弗氏佐劑(Difco，Detroit，MI，USA),鼠源肽，CFA完全費(fèi)氏佐劑。

1.2 方法

1.2.1MuSK小鼠模型的制備

雌性C57BL/6小鼠40只，分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各20只小鼠。通過(guò)胰島素注射器從尾靜脈給藥2次對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。第1次實(shí)驗(yàn)組20只小鼠麻醉并用30μg的MuSK-弗氏佐劑免疫，對(duì)照組20只小鼠僅用CFA免疫。28 d后進(jìn)行第2次免疫：實(shí)驗(yàn)組給予MuSK-弗氏佐劑，對(duì)照組給予等量PBS。適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行造模。造模第1天在 4個(gè)位置(兩只后腳和肩部)分別注射免疫抗原(每個(gè)部位50 μL，含12.5ug鼠源肽，CFA完全費(fèi)氏佐劑)；造模第30及50天再次在上述4個(gè)位置(兩只后腳和肩部)分別注射免疫抗原(每個(gè)部位50 μL，含12.5ug 鼠源肽，CFA不完全費(fèi)氏佐劑)[2]。參照文獻(xiàn)要求[1]，實(shí)驗(yàn)組第2次免疫后每周測(cè)抓力，做翻籠試驗(yàn)，每天測(cè)臨床評(píng)分和體質(zhì)量，第70天后每天對(duì)發(fā)病情況進(jìn)行評(píng)分。

1.2.2臨床檢查：臨床檢查是先將小鼠在平臺(tái)上放置3 min，觀察小鼠的精神狀態(tài)，有無(wú)虛弱，脫水，小鼠的活動(dòng)情況，四肢肌力，有無(wú)癱瘓等，以便與鍛煉后情況進(jìn)行對(duì)照。對(duì)小鼠按下面的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。

(1)按國(guó)際重癥肌無(wú)力小鼠臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分(Clinical scores)[2]:首先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)鍛煉，放置金屬網(wǎng)格，輕抓小鼠的尾巴，小鼠抓住金屬網(wǎng)格時(shí)，再將老鼠提起，如此重復(fù)20次，然后讓小鼠自由行走并進(jìn)行測(cè)分：

1)0分，鍛煉前活動(dòng)正常，沒(méi)有虛弱或疲勞的跡象。在標(biāo)準(zhǔn)鍛煉后，老鼠似乎比正常情況下不太活躍，或顯示出其他輕微疲勞虛弱的跡象，

2)1分，鍛煉前活動(dòng)正常，但在標(biāo)準(zhǔn)的鍛煉方案后，它會(huì)俯臥不動(dòng)，下巴著地，不能抬頭，縮成一團(tuán)，活動(dòng)性減少，頭部和尾巴擱在工作臺(tái)上(懸掛時(shí)間小于60 s)。當(dāng)小鼠達(dá)到這個(gè)等級(jí)時(shí)，應(yīng)將柔軟、潮濕的食物放在籠子的地板上。

3)2分，鍛煉前小鼠即出現(xiàn)活動(dòng)性減少，常俯臥不動(dòng)，頭部及尾巴擱在工作臺(tái)上，縮成一團(tuán)，但未出現(xiàn)脫水，癱瘓，很大程度上保持著腦袋不動(dòng)和尾巴休息(懸掛時(shí)間小于30 s)。

4)3分，小鼠即非常虛弱，脫水，癱瘓，體質(zhì)量明顯下降。評(píng)分為3分的小鼠出現(xiàn)脫水和癱瘓，體質(zhì)量下降達(dá)15%(懸掛時(shí)間=0)。

5)4分，小鼠死亡。

(2)抓力試驗(yàn)和翻籠試驗(yàn)

1)抓力試驗(yàn)(Grip strength)

輕抓小鼠的尾巴，當(dāng)小鼠懸起時(shí)，下面放金屬網(wǎng)格，老鼠抓住金屬網(wǎng)格時(shí)，將老鼠提起，重復(fù)20次后測(cè)拉力。

一端固定在拉力器上，測(cè)力器做成前端網(wǎng)格形。抓住小鼠尾巴，讓小鼠抓住測(cè)力器的前端，用力拉小鼠的尾巴，當(dāng)小鼠力量不夠抓住測(cè)力器前端時(shí)，此時(shí)測(cè)力器顯示為抓力。

2)翻籠試驗(yàn)(Inverted screen test)

翻籠試驗(yàn)是用來(lái)定量評(píng)估四肢肌力的測(cè)試方法。小鼠被放在了網(wǎng)格的中心后立即旋轉(zhuǎn)到倒立位置，穩(wěn)定地保持在軟墊上方50 cm。記錄小鼠掉下的時(shí)間,觀察時(shí)間限定在300 s。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,MuSK-MG小鼠建模成功率采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。

2 結(jié)果

評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1，評(píng)分為≥1提示造模成功，建模成功率50%；3分和4分的小鼠抓力試驗(yàn)和翻籠試驗(yàn)明確減退，有利于下一步藥物試驗(yàn)。評(píng)分為1至4分為造模成功，成功率為50%，P=0.00026，見(jiàn)表1。

表1 評(píng)分結(jié)果Table 1 Mouse clinical score results

3 討論

AchR自身抗體主要在免疫球蛋白G(IgG)IgG1和IgG3亞型中，直接阻斷受體功能。相比之下，MuSK抗體主要是IgG4，不激活補(bǔ)體，而是抑制MuSK在終板誘導(dǎo)AchR的正常聚集[3]。肌肉活檢和上肢肌肉的電生理研究沒(méi)有顯示任何AchR減少或補(bǔ)體沉積在MuSK陽(yáng)性的MG中。MuSK-Abs的致病性已經(jīng)通過(guò)患者純化IgG被動(dòng)轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上得到證實(shí)[4]。與正常對(duì)照相比，MuSK-Ab 陽(yáng)性的MG患者輔助性T細(xì)胞(Th)Th 1和Th17水平更高，而B(niǎo)10細(xì)胞百分比更低。由于B細(xì)胞10是免疫耐受和免疫激活調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)，這些結(jié)果與Th1 /Th17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和自身抗體產(chǎn)生是一致的，是 MuSK-MG的主要機(jī)制[5]。

MuSK-MG的小鼠模型中最近研究結(jié)果表明，吡斯的明加劇了終板AchR損失，而3,4-二氨基吡啶增強(qiáng)了神經(jīng)肌肉傳遞[6]。

C57BL/6、AJ 和 bm12小鼠容易造模，但是BALB/c不適合用來(lái)做MuSK小鼠模型。A/WySnJ,A/J,DBA/2,FVB/N小鼠更適合作為造模小鼠，具體原因不明[7]。必須定期監(jiān)測(cè)動(dòng)物，并防止不必要的痛苦。在開(kāi)始治療前幾天開(kāi)始的被動(dòng)免疫注射過(guò)程中，每天都要進(jìn)行體質(zhì)量和疲勞虛弱的測(cè)量，以使動(dòng)物熟悉操作人員。主動(dòng)免疫研究的時(shí)間較長(zhǎng)(4至11周)。對(duì)于這類研究，在第2次免疫接種之前，可以接受較不頻繁的例行檢查，到第2次免疫接種時(shí)應(yīng)開(kāi)始每日檢查。由于老鼠有一個(gè)晝夜節(jié)律的活動(dòng)周期，一個(gè)有規(guī)律的12小時(shí)的光/暗周期應(yīng)該在每天的同一時(shí)間進(jìn)行，最好是上午10點(diǎn)到下午1點(diǎn)[8-9]。

本研究按照國(guó)外文獻(xiàn)制備MuSK-MG的小鼠模型，統(tǒng)一測(cè)評(píng)方法，與現(xiàn)有研究結(jié)果一致，造模方法可行。有利于重癥肌無(wú)力疾病的進(jìn)一步研究。