大、小鼠CO2安樂死方法研究

何嘉玲 王天奇 張長勇 暴 國 李 楠 孫德明

(國家衛(wèi)生健康委科學技術(shù)研究所，北京 100081)

據(jù)小鼠處死方法的文獻統(tǒng)計，在我國頸椎脫臼法和斷頭法使用率最高，但這兩種物理方法對操作者的專業(yè)技術(shù)要求較高。如操作不熟練將使動物遭受不必要的痛苦，不符合實驗動物福利倫理的要求。其次是使用麻醉劑，但麻醉劑存在無法大量使用和較大副作用和安全隱患等問題。近年來國際上有大量報道使用吸入CO2實施安樂死的文章，但在我國應用CO2實施安樂死的研究報道較少。

“安樂死”(euthanasia)一詞源自希臘語，‘eu’意思是“好的”，‘thanatos’意思是“死亡”，即最小疼痛和痛苦的死亡。依據(jù)動物福利和動物保護的原則，實驗者應在適當?shù)臅r機采取適當?shù)姆椒▽游锸┬邪矘匪馈Ｔ趶V泛閱讀國內(nèi)外CO2吸入安樂死文獻的基礎(chǔ)上，本文將就大小鼠吸入CO2實施安樂死的應用細節(jié)，包括評價體系，具體實施方法、注意事項以及仍需要研究的問題作一綜述，為CO2在安樂死中的應用提供借鑒。

1 安樂死方法使用的原則

施行安樂死要求在動物的抓取和處死全過程中將動物的疼痛和痛苦降到最低，并盡量減少動物喪失意識(LOC)前的痛苦[1]。實施安樂死應考慮以下幾個要素：①導致意識喪失的同時盡量減少動物的痛苦;②導致意識喪失所需要的時間;③可靠性;④不可逆性;⑤可操作性和人員的安全性;⑥與實驗目的相適應的可兼容性;⑦對觀察者和操作者情緒的影響;⑧進一步評價、檢查及使用動物組織的兼容性;⑨藥物的可用性和人員濫用的可能性;⑩符合實驗要求的經(jīng)濟性。此外，安樂死的實施必須遵循實驗動物福利倫理的相關(guān)標準和要求[2]。

2 吸入CO2在大小鼠安樂死中的應用

吸入CO2可引起呼吸性酸中毒并通過降低細胞內(nèi)pH產(chǎn)生可逆麻醉狀態(tài)，可靠而迅速地導致意識喪失。操作過程不需要高度專業(yè)化的設備，對人員要求不高且安全危害小。其尸體殘留物不會或很少對后續(xù)實驗產(chǎn)生干擾和危害。然而，由于有研究顯示大小鼠對CO2氣體表現(xiàn)出厭惡情緒，且高濃度的CO2會導致疼痛和呼吸困難，在過去的幾十年中，使用CO2作為安樂死藥物受到了嚴密的審查。但鑒于CO2安樂死的高效性和安全性，目前國際上CO2應用于安樂死的報道大量增加。在我國也有一些研究者開始選擇使用CO2處死大小鼠[3]，但報道比例遠遠低于物理方法(頸椎脫臼法和斷頭法)。

2.1 CO2安樂死過程中壓力和疼痛的判斷及存在的問題

最佳的安樂死技術(shù)旨在引導快速無意識，其次是快速死亡。從動物角度看，手術(shù)麻醉和安樂死的麻醉誘導沒有本質(zhì)區(qū)別。公認的麻醉階段有4個。階段I被定義為從誘導到意識喪失的時間段。階段II是從意識喪失到對刺激的反應喪失的時間段。階段III是深度麻醉階段，伴隨失憶，鎮(zhèn)痛和肌肉松弛。階段IV是在上述基礎(chǔ)上，心血管反應和呼吸功能停止。對安樂死方法的評估而言，階段I動物的感受是關(guān)注的焦點。已知脊髓區(qū)域負責應對有害化學刺激，大鼠研究表明，當吸入25%的CO2時，延髓背角神經(jīng)元的放電增加，CO2濃度在37%和87%之間發(fā)生近線性增加，即CO2濃度增加，疼痛增加[4]。然而確定動物何時變得無意識并不是一項簡單的任務。以下簡述幾種可能的評估方式和存在問題。

2.2 評價體系

2.2.1應激激素變化評判：任何一種安樂死的方法都會不同程度導致動物產(chǎn)生壓力。任何壓力，都會引發(fā)一系列被稱為壓力反應的活動。動物機體通過交感神經(jīng)-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)(SAM)和下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)這兩條途徑產(chǎn)生急性應激反應。當大腦感受到壓力時，SAM幾乎立即通過釋放主要來自交感神經(jīng)末梢的去甲腎上腺素和來自腎上腺髓質(zhì)的腎上腺素來響應。同時，沿著HPA，應激反應開始于杏仁核，啟動促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子分泌。這種激素隨后刺激垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)。ACTH作用于腎上腺皮質(zhì)釋放皮質(zhì)酮。為了評估這種應激反應，可以測量HPA軸和SAM激素的組分。有研究表明，小鼠ACTH水平在暴露于CO2氣體等應激物后大約30 s內(nèi)增加，且去甲腎上腺素在CO2暴露后5 s內(nèi)升高，而皮質(zhì)酮水平的升高大約需要4 min。鑒于皮質(zhì)酮產(chǎn)生的延遲效應，一般通過檢測ACTH，去甲腎上腺素和腎上腺素評價壓力的差異。

2.2.2行為學評判：對安樂死的壓力、疼痛/痛苦的反應還表現(xiàn)在動物的行為中，包括逃跑傾向、掙扎、攻擊性行為、痙攣、呻吟等。有研究顯示，用CO2安樂死的小鼠在臥位時是不敏感的，而用異氟醚安樂死的小鼠在最初臥位時就有蹬踏反應。然而因為運動和對刺激的反應可能發(fā)生在沒有脊髓結(jié)構(gòu)的情況下，因此僅利用蹬踏作為安樂死壓力的評估方法有其不足。

2.2.3神經(jīng)反射評判：腦電圖(EEG)是評估麻醉深度的一種方法，在動物中，EEG已被用于評估各種麻醉劑以及斷頭術(shù)，頸椎脫臼，異氟烷，氯化鉀或CO2過量使用的安樂死。目前評估嚙齒類安樂死腦電圖反應的研究較少，少量的研究發(fā)現(xiàn)斷頭后皮質(zhì)功能中斷而皮質(zhì)活動仍存在15到20 s。但通過EEG無法確定的無意識狀態(tài)的確切發(fā)生，因此將EEG用作無意識狀態(tài)的確定，仍需要進一步的實驗證據(jù)。

2.2.4心血管反應的評判：疼痛和壓力會導致兒茶酚胺水平升高，隨后心率和血壓升高。動物研究發(fā)現(xiàn)安樂死試劑可導致心率和血壓驟升，說明安樂死對動物產(chǎn)生了壓力，但同時也發(fā)現(xiàn)，壓力水平并沒有因使用安樂死的方法不同而有所不同。如果壓力水平與安樂死方法沒有對應關(guān)系，那么心血管參數(shù)的變化就不是評判安樂死壓力水平的理想?yún)?shù)。

2.3 CO2安樂死的具體實施方法及倫理分析

CO2安樂死過程中，動物在無意識前的不適與CO2濃度和室腔換氣率(CRR)相關(guān)，研究表明混合使用麻醉劑和其他吸入性氣體能一定程度上改善動物無意識前的感受。因此，以下將重點討論CO2安樂死實施過程中，最佳的CO2濃度和CRR以及輔助性麻醉藥物或氣體的使用。此外，還將討論特殊時期的大小鼠如孕鼠，胎鼠和新生鼠等的CO2安樂死實施方法，以及不同品種和飼養(yǎng)環(huán)境等對安樂死實施的影響。

腔室內(nèi)CO2最佳更換率及濃度實驗表明：小鼠實驗發(fā)現(xiàn)不同的CO2CRR對心血管數(shù)據(jù)、疼痛或ACTH水平的影響都沒有顯著差異。因此建議使用較快的CO2流速較快誘導安樂死。然而也有研究得出與此相反的結(jié)果，在HiRoad安樂死室(Lab Etc.，Clayton，DE)中比較使用慢流(30%)CO2和快速流(70%)CO2實施安樂死發(fā)現(xiàn)，快速流動CO2中CD1小鼠焦慮行為增加。提示安樂死過程中使用的技術(shù)和評價指標的差異可能影響結(jié)果的判斷。

有證據(jù)表明不同濃度的CO2會導致動物的痛苦和/或疼痛。根據(jù)Leach的研究，在人類，大鼠和貓中，大多數(shù)傷害感受器能被40 %CO2激活[5]。在小鼠中，已經(jīng)顯示濃度為10 %的CO2就可以通過凍結(jié)和激活邊緣結(jié)構(gòu)包括杏仁核誘發(fā)恐懼[6]。在大鼠中，二氧化碳濃度達到30%～40%就可以導致無意識；然而實驗發(fā)現(xiàn)即使使用100 %CO2預先填充氣室，在大鼠和小鼠中誘發(fā)快速皮質(zhì)腦的損傷也分別需要39 s和30 s，此前，動物將飽受痛苦。

因此根據(jù)上述研究數(shù)據(jù)，使用較高的流速以及低于誘發(fā)疼痛的濃度(<40%)是CO2輸入較理想的方式。目前CO2安樂死的推薦程序為：使用氣缸里的壓縮CO2并結(jié)合流量計以精確調(diào)節(jié)流量。起初氣流應恒定在15%至35%V/min，在LOC后(一般需要49 s)增加流量[7]。同時在臨床死亡后應至少維持1 min氣流，避免逆轉(zhuǎn)。此外，國內(nèi)研究者趙建文等關(guān)于安樂死箱設計的研究報道可為安樂死容器的選擇提供一定的參考[8]。

2.4 CO2與其他麻醉劑的聯(lián)合使用

研究表明，加入一氧化二氮(N2O)、氧(O2)或異氟醚可以改善CO2暴露的不良反應，減少呼吸困難的發(fā)作。與單獨使用CO2相比，N2O與CO2的聯(lián)合使用能將LOC的時間縮短10%。但N2O存在潛在的人類濫用的危險；O2的加入可以防止缺氧，從而減少痛苦。然而，也有研究表明將O2添加到CO2中對動物厭惡情緒的改善效果甚微甚至沒有效果。補充O2還可能引起LOC之前的肺部出血[9]。因此，美國獸醫(yī)協(xié)會(American Veterinary Medical Association，AVMA)安樂死小組認為，將O2與CO2聯(lián)合用于安樂死沒有任何優(yōu)勢；在小鼠實驗中，異氟醚的加入可在一定程度上(10%)減少動物LOC的時間，但研究發(fā)現(xiàn)與30%CO2相比，小鼠對異氟醚產(chǎn)生較強烈的抵抗和焦慮行為，包括逃避及蹬踏反應等[10]。雌鼠在斷頭術(shù)前短暫的異氟醚暴露還可提高血漿皮質(zhì)醇濃度，雄性則出現(xiàn)ACTH分泌量增加，表明壓力增大[10]。綜上所述，異氟醚盡管在一定程度上減少了動物安樂死LOC的時間，但是給動物增加了更大的壓力，單獨使用異氟醚或與CO2混合使用施行安樂死并不合理。但有一種情況例外，與異氟醚相比，CO2安樂死會導致較高頻率的肺組織學損傷。因此在需要肺組織學分析的情況下，可優(yōu)先選擇異氟醚。

3 胎鼠和新生鼠

針對胎兒安樂死建議的具體方法基于其神經(jīng)元發(fā)育情況。由于具備非功能性大腦皮質(zhì)和皮質(zhì)下腦結(jié)構(gòu)，小于15日齡胎鼠被認為不具備疼痛感知，處死母鼠的同時即能引起胎兒的快速無痛苦死亡。因此，安樂死的實施主要針對15日胎齡后的胎鼠。但在安樂死方法的選擇上，還應兼顧實驗目的和結(jié)果，尤其是需要獲取胎兒或種質(zhì)進行下一步實驗時。有研究比較了頸椎脫臼與CO2安樂死，發(fā)現(xiàn)兩種方法并沒有造成胚胎數(shù)量及胚胎生存力的差異。然而，也有研究工作表明動物用CO2安樂死后精子和卵母細胞功能與斷頭法比較存在差異，因此實驗者應該同時兼顧實驗目的和福利倫理要求選擇恰當?shù)陌矘匪婪椒ā．斕翰挥糜谶M一步的實驗時，對母鼠施行安樂死則可重點考慮較快的腦缺氧和最小的子宮破裂，例如通過使用CO2安樂死后進行頸椎脫位。

研究表明新生的大小鼠對缺氧有抵抗，CO2暴露后成年嚙齒動物與新生兒的死亡時間有巨大差異。在大鼠中，隨著年齡的增長死亡時間穩(wěn)步下降，即日齡越小，所需LOC時間越長。10日齡小鼠CO2暴露5 min后會100%的被安樂死。100%的死亡時間在第0至10天之間每天降低3 min[11]。因此，對新生大小鼠施行CO2暴露安樂死，必須徹底修改成年動物所使用的劑量和方法。此外，當使用CO2施行安樂死時，還觀察到小鼠心臟停博后的恢復，因此建議延長CO2暴露時間，并應用二次安樂死方法，如斷頭術(shù)以減少動物的痛苦。

4 影響安樂死的其他因素

動物的品種和飼養(yǎng)環(huán)境也會影響HPA對壓力源的反應，因此CO2安樂死除了考慮CO2本身以外，還應考慮其他因素對動物福利的影響。在實施CO2安樂死期間，C57BL /6小鼠比CD1小鼠喪失意識時間更短，但反應更劇烈。在21%CO2CRR下，BALB /c小鼠肺出血的嚴重程度較C57BL /6小鼠高[12]。因此，應該兼顧實驗目的和動物福利選擇恰當?shù)陌矘匪婪椒ā４送猓芯匡@示小鼠對共同飼養(yǎng)了14 d或21 d其他小鼠，表現(xiàn)出同情心，但對于一個陌生小鼠沒有反應[13]。因此，在實施安樂死過程中小鼠是否熟悉那些被同時安樂死的小鼠，也應予以考慮。

5 小結(jié)

盡管CO2應用于安樂死存在一些有爭議的問題，但作為一種安全有效、簡便易行、成本低廉的安樂死方法，越來越受到研究人員的青睞。目前，在安樂死的實施方法中，存在一些不同的觀點。關(guān)于麻醉藥品的使用，一些研究者主張先通過麻醉藥實現(xiàn)意識喪失，然后使用CO2達到死亡[14]。而另一些研究者認為使用替代性氣體如異氟醚、氬氣和氮氣對安樂死并沒有人性化改進；關(guān)于CO2的流速也存在兩種觀點，AVMA安樂死小組建議使用10%至30%CRR的CO2[14-15]。減少動物痛苦。而另一種觀點認為，只要動物沒有經(jīng)歷疼痛(小鼠在CO2達到40%的疼痛誘導水平之前無疼痛)，推薦使用更快的CO2CRR來減少小鼠LOC的時間；此外，安樂死方法選擇的另一難點在于動物的意識的評判。評判標準能否真實客觀地與動物的疼痛/痛苦相關(guān)聯(lián)是評判安樂死方法選擇的關(guān)鍵。因此，在后續(xù)的研究中，仍然需要積累更多的關(guān)于安樂死評判的數(shù)據(jù)，更加客觀真實地判斷動物在LOC前的生理和心理狀態(tài)，為安樂死方法的選擇提供確切的依據(jù)。

我們認為盡管CO2在安樂死過程中出現(xiàn)壓力，但目前沒有一種安樂死方法不會導致壓力。因此，在沒有更好的替代藥物的情況下，鑒于CO2的簡便易行，危害小，成本低，使用CO2實施大小鼠的安樂死不失為一種較理想的辦法。