杜仲葉化學成分研究進展

吳紅艷,彭呈軍,鄧后勤,*

(1.湖南農業大學食品科學技術學院,湖南長沙 410128; 2.慈利縣九九農業開發有限公司,湖南張家界 427200)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.),又名膠木,為杜仲科植物,種植范圍廣泛,多分布在長江中游和南部各省,具有抗氧化、降血壓、安胎、預防肥胖[1]、強筋健骨、改善糖代謝[2-3]、增強免疫力等功效[4-6],作為中藥在中國已有上千年的歷史。

然而,目前對于杜仲的開發利用并不全面,大多局限于杜仲皮和杜仲膠,一直以來杜仲主要以杜仲皮入藥,杜仲膠也是一種天然高分子材料,可作為一種天然橡膠被廣泛地應用于各行業領域,而資源更豐富的杜仲葉卻一直缺乏有效的加工利用。現代研究表明,杜仲葉(Eucommia Folium)與杜仲皮有相同的有效成分和藥理作用[7],目前經過分離和鑒定的有機化合物約有70種以上,無機礦物元素不少于15種,大致可分為環烯醚萜類、木脂素類、黃酮類、杜仲膠、苯丙素類、酚類、氨基酸、多糖類、脂肪酸和維生素。杜仲葉屬可再生資源,產量巨大,若對其進行加工利用,既可彌補傳統的藥源不足,還可以把天然杜仲葉應用到各個領域,尤其是食品加工領域,利用杜仲葉多種生物活性,將其作為保健品原料和添加劑,開發出營養價值較高的功能性產品,這將對食品行業的發展起到積極的推動作用。本文對近年來杜仲葉化學成分的研究現狀進行綜述,以期為杜仲葉的進一步開發利用提供參考。

1 化學成分的研究

1.1 環烯醚萜類化合物

環烯醚萜類化合物性質不穩定,容易氧化分解,在新鮮的杜仲葉中含量較高,現已從杜仲葉中分離得到20多種環烯醚萜類化合物,主要包括車葉草苷、京尼平苷酸[8]、桃葉珊瑚苷、哈帕甙乙酸酯、筋骨草苷、杜仲苷、杜仲醇和雷撲妥苷。

張倩茹等[9]通過比色法測定環烯醚萜類化合物的含量,正交試驗優選出最佳的提取條件,發現當料液比為1∶12 (g/mL)、85%乙醇作為溶劑時,在80 ℃條件下熱回流提取3次,每次45 min,提取率最高,為0.507%。劉靜等[10]用回流法、超聲波法、微波法和浸提法提取桃葉珊瑚苷和京尼平苷酸,發現回流法提取率最高,桃葉珊瑚苷達58.79 μg·g-1,京尼平苷酸達107.96 μg·g-1,確定最佳提取方案為乙醇濃度60%、料液比1∶25 (g/mL)、提取4次。Bianco等[11]用硅膠和纖維粉層析法研究杜仲葉乙醇提取物,發現至少存在6種環烯醚萜類化合物,層析法純化分離后發現其中四種為桃葉珊瑚苷、哈帕甙乙酸酯、筋骨草苷和雷撲妥苷,另外兩種新的化合物僅在秋季存在于植物中,作者主要對極性化合物2-杜仲醇進行研究,發現該物質可產生乙?；苌?,無OH吸收,并含有4個乙?；?利用雙共振技術簡化結構,分離純化得到環烯醚萜類化合物新戊烯基四萜醇。Hosoo等[12]用乙醇作為提取劑,通過水蒸氣法提取杜仲葉中的京尼平苷酸和車葉草甙,測得提取物中的含量分別為65.8、11.4 mg·g-1,并發現提取物可改善內皮血管功能,動脈膜厚度(101.9±1.4) μm明顯低于對照組(124.7±5.9) μm,血漿中NO水平(11.75±1.95) μm高于對照組(6.37±0.95) μm。Yang X等[13]以離子液體為提取劑,超聲提取杜仲葉中桃葉珊瑚苷,確定在25 ℃條件下,濃度為0.5 mol/L的離子液體對桃葉珊瑚苷的提取效果最好,再用大孔吸附樹脂富集純化提取液中的桃葉珊瑚苷,得洗脫液中桃葉珊瑚苷的純度為79.41%,回收率為72.92%。鄭陽等[14]用30%的乙醇超聲提取,95%的乙醇醇沉粗體液,減壓濃縮得濃縮液,再用乙酸乙酯和正丁醇萃取濃縮液,大孔樹脂分離、半制備色譜純化,質譜、光譜、核磁共振等方法檢測為杜仲醇,HPLC定量分析杜仲醇的純度達95.12%。

以上采用的提取檢測方法因提取物質不同各有優缺點,回流法提取所得產物的提取率高,穩定性好,比色法測定具有快捷、高效的特點,適用于環烯醚萜類化合物的提取,半制備液相色譜法可用于分離高純度的單體,繼而用于后續加工利用,操作方便,對于提取物的純化大多采用大孔樹脂,大孔樹脂純化可以提高有效成分分離效率,具有快捷、省時、低成本的特點。

1.2 木脂素類化合物

木脂素類化合物包括松脂素、橄欖脂素[15]、二氫脫氫二松柏醇、定向脂醇二葡萄糖苷等27種化合物。其中主要成分為松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinol diglucoside,PDG),具有降血壓的作用。

Gu J等[16]研究杜仲葉提取物和醛糖還原酶抑制劑對血管重塑的影響,發現木脂素可以逆轉血管重塑,可能原因是抑制了醛糖還原酶的表達,因此,醛糖還原酶可能是木脂素用于治療心血管疾病的靶點。鄭雪等[17]用85%的乙醇超聲提取新鮮杜仲葉,真空抽濾得濾液,用制備薄層分離純化濾液得固體提取物,HPLC測定用制備薄層法分離得到的PDG產物溶液和除去溶劑后的PDG產物中的PDG含量,結果表明提取產物中的PDG含量比新鮮杜仲葉中的含量高40～50倍,該實驗方法操作簡單快捷,減少了溶劑用量,但由于其他組分存在導致薄層分離時PDG斑點難以分開,因此,木脂素類化合物分離方法還需要進一步研究。

1.3 黃酮類化合物

杜仲葉中黃酮類物質含量較高,在抗氧化、抗癌、預防吸血管疾病等方面具有顯著效果。目前,已從杜仲葉中發現十幾種黃酮,主要有槲皮素、槲皮素苷、紫云英苷、山奈酚、異槲皮甙、蘆丁、陸地錦甙等。

賈征等[18]采用超聲提取法,探討了乙醇為溶劑提取杜仲葉黃酮的最佳提取條件為40%的乙醇,固液比1∶60 (g/mL),浸泡2.5 h后提取2次,每次1 h,并通過抗氧化研究發現,黃酮可抑制脂質過氧化和紅細胞氧化溶血。王學軍等[19]分別探究了超聲提取法、微波提取法、熱水回流提取法不同方法及甲醇、乙醇、水等不同提取溶劑對杜仲葉中綠原酸、蘆丁、槲皮素、山奈酚的提取效果的影響,發現超聲提取法耗時短,產率高,70%的甲醇提取效果較好。王志宏等[20]先用95%的乙醇超聲提取,過濾提取液,再用 60%的乙醇超聲提取濾渣,合并兩次濾液,通過單因素和正交試驗確定最佳提取工藝為料液比2∶1 (g/mL),水解溫度80 ℃,水解時間3 h,鹽酸濃度6 mol/L,黃酮苷元含量為2.512%,薄層色譜測得純化后黃酮苷元含量為12.87%,HPLC測得二次純化后的含量高達63.19%。許蘭波等[21]以甲醇為溶劑,在100 W下超聲提取杜仲葉黃酮,HPLC測定出6種黃酮:槲皮素-3-O-葡萄糖(1→2)葡萄糖苷、槲皮素-3-O-阿拉伯糖(1→2)葡萄糖苷、槲皮素-3-O葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素。Huang W等[22]為研究黃酮的抗氧化效果,用40%的乙醇超聲提取杜仲葉黃酮,測得含量為17.2%,大孔樹脂純化后純度為78.6%,發現黃酮對羥基的抑制效果為1.8%,還原能力最差,為0.6%,對大鼠紅細胞溶血抑制效果為76%,對丙二醛的產生也具有良好的抑制效果,抑制作用最好的是脾臟,為99.12%。許先猛等[23]通過單因素試驗,結合正交試驗探討了乙醇為溶劑超聲提取杜仲葉黃酮的最佳提取工藝,結果表明在提取功率600 W、超聲時間30 min、乙醇濃度60%、料液比1∶15 (g/mL)、提取2次的條件下,黃酮得率最高,為2.04%。柴建新等[24]在用60%的乙醇水浴提取、大孔樹脂吸附與AL(NO3)3絡合法測量杜仲葉黃酮的過程中,通過加入亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑優化比色條件,減少分析時間,達到精確測量的效果,測得黃酮含量為4.86%。董興葉等[25]采用亞臨界水萃取杜仲葉黃酮類化合物,通過單因素及正交試驗確定最佳工藝條件為:提取溫度120 ℃、時間30 min、料水比1∶25 (g/mL)、壓力1.0 MPa,黃酮類化合物得率為3.9%±0.06%。

超聲輔助提取和微波輔助提取是提取杜仲葉總黃酮的常用方法,與其他方法相比大大縮短了提取時間,提高提取率,超聲提取可在室溫條件下進行,設備簡單,操作方便,是提取黃酮的首選方法。對于黃酮類化合物化學成分的鑒定分離多采用色譜法,實驗過程繁瑣,實驗要求高,但是結果精確。亞臨界萃取法的相關研究較少,相較于傳統水提法可大幅度提高提取率,是一種綠色環保、前景廣闊的提取方法,因為亞臨界水萃取需要在一定壓力下進行,所以更適用于工業化生產。

1.4 杜仲膠

杜仲膠存在于杜仲樹不同部位的含膠細胞中,為反式-聚異戊二烯[26],是一種天然的高分子物質,在杜仲葉中的含量相對較低。

龔兆全等[27]用堿浸法處理杜仲葉,正己烷-丙酮提取法提取杜仲膠,研究赤霉素(GA3)、萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、6-芐氨基嘌呤對杜仲膠含量的影響,發現GA3處理的杜仲膠含量最高,2,4-D處理的杜仲膠含量最低,對生產加工中提高杜仲膠含量具有參考價值。Xia L等[28]采用冷熱水和石油醚交替法提取杜仲膠,將提取出來的杜仲膠用于輪胎胎面設計,經機械處理后,在30 kDa范圍內,測定橡膠試樣的力學性能、拉伸強度、斷裂伸長率等指標,發現與沒有杜仲膠相比,熱積累都有所增加。Takeno S等[29]比較索氏提取法和2 mL提取法提取杜仲膠的提取效果,索氏提取法是在120 ℃條件下加入100 mL乙醇提取10 h,之后在150 ℃條件下加入50 mL甲苯提取12 h,甲醇沖洗甲苯提取物中的殘渣,稱其重量;2 mL提取法是將15 mg杜仲葉粉末懸浮于1.2 mL乙醇中,以14000 r/min離心1 min,收集殘渣,以甲苯為溶劑,提取杜仲膠;發現兩種方法提取率幾乎相同,前者為4.03%±0.29%,后者為4.01%±0.25%,RSD分別為7.11%和6.29%;并利用傅里葉變換紅外光譜和熱解-氣相色譜/質譜定量測定,發現兩種提取方法杜仲膠分子量分布幾乎相同。劉慧東等[30]以減重法為原理采用濾袋技術測定杜仲葉中杜仲膠含量,結合索氏提取技術,設計正交試驗研究濾袋孔徑、樣品重量和提取時間對提取率的影響,將杜仲葉粉末裝入濾袋中超聲洗滌40 min,再用石油醚索氏提取,確定最佳工藝參數為濾袋孔徑25、10 μm,樣品質量0.1～0.5 g,索氏提取60 min,與傳統堿煮法測定杜仲膠提取率相比,濾袋技術所需的樣品量較小,預處理步驟更簡潔,節約成本,不僅可以快速測量杜仲膠的含量,而且測量結果更加接近真實值,可廣泛應用于杜仲膠產業、杜仲膠育種、大量樣本快速檢測等方面。同時,濾袋法不需要大型儀器設備,操作簡便易行,有利于產業化過程中對材料品質的估測。

1.5 苯丙素類化合物

苯丙素類是形成木脂素的前體,包括香豆酸、松柏酸、二氫咖啡酸、咖啡酸、丁香苷、間羥基苯丙酸、愈創木丙三醇等,目前對于苯丙素類的報道較少,大多集中在綠原酸、香草酸等活性成分方面,對綠原酸的含量和活性研究最多。

李旭等[31]通過響應面設計試驗得出了杜仲葉綠原酸最佳提取工藝條件為料液比26∶1 (mL/g)、提取時間2.5 min、微波功率722 W、乙醇體積分數30%,在此條件下,綠原酸含量達到29.74 mg/g,且具有較好的降壓效果。何念武等[32]比較了以乙醇為溶劑的溶劑提取法、水提取法、酶法、超聲波輔助法和以水為助提劑的超臨界流體萃取法5種方法對杜仲葉綠原酸的提取效果,發現水提取法綠原酸含量最低,超臨界流體萃取法綠原酸含量最高,乙醇提取法是最佳選擇。張蕾等[33]探討了超聲提取杜仲葉綠原酸的最佳工藝,發現在40%的乙醇、料液比1∶35、浸泡60 min的條件下,超聲提取30 min,綠原酸得率最高,為8.0418 mg/g。張雪梅等[34]通過實驗比較水提取法和酶提取法的提取效果,發現酸性蛋白酶提取所得的綠原酸含量最高,為26.4%,水提取的含量最低,為12.1%。楊凌等[35]研究了樹齡、存儲時間、陽光對杜仲葉綠原酸含量的影響,以40%的乙醇為溶劑水提杜仲葉綠原酸,發現樹齡越大、存儲時間越長綠原酸的含量越低,生長在陽坡上的杜仲葉綠原酸含量高于生長在陰坡上杜仲葉綠原酸的含量。張忠立等[36]使用色譜方法從杜仲葉中分離出9個苯丙素類化合物,分別為:咖啡酸、綠原酸甲酯、紫丁香苷、愈創木基丙三醇(4)、5-甲氧基-愈創木基丙三醇(5)、5,9-二甲氧基-愈創木基丙三醇(6)、9-正丁基-愈創木基丙三醇(7)、9-正丁基-愈創木基丙三醇(8)、8′-甲氧基-橄欖素(9),研究了杜仲葉和皮的差異性成分和特征性成分,為臨床上“以葉代皮”提供理論基礎。Shi X L等[37]用80%的乙醇回流提取杜仲葉,獲得粗提物,再依次用氯乙烯、乙酸乙酯和正丁醇分離粗提物,經光譜分析得到兩對苯丙素對映體,命名為化合物1和化合物2,兩者均為無色膠狀物質,核磁共振測得其結構中含有芳環、甲氧基,通過分析發現兩者平面結構一致。

綜上所述,對于綠原酸的提取大多采用乙醇作為提取劑,而對于提取方法,水提取雖然操作簡單,實驗方便,但是提取率最低,酶提取法因酶可以破壞葉片結構和細胞壁具有較好的提取效果,常用的提取方法為超聲提取法和微波提取法,操作方便,節約成本。

1.6 多糖類物質及脂肪酸

杜仲葉中的多糖易溶于水,無味,為灰白色粉末,不溶于高濃度的有機溶劑。徐賢柱等[38]以杜仲葉為原料,水加熱回流法提取杜仲多糖,苯酚-硫酸法測量杜仲粗多糖提取率為0.5245%,純度為67.3%,研究發現多糖可以提高血清中白細胞介素和免疫球蛋白的含量,提高免疫力,但對胸腺功能無顯著影響。雷燕妮等[39]采用水提醇沉法提取杜仲多糖,測得多糖提取率5.76%,多糖中總糖含量為75.3%,研究發現多糖可以改善血脂水平,降低動脈硬化和冠心病的發生風險,揭示了降血脂的作用機制,對杜仲葉降血脂的研究進行了補充。Tomoda等[40]通過水提取法提取,乙醇沉淀,硫酸鈉溶溶解沉淀,十六烷基溴化銨處理溶液,色譜分析法分析杜仲糖B聚糖,發現含有L-阿拉伯糖(13.5%)、D-G和ICTOSE(8.5%)、L-鼠李糖(34.1%)、D-半乳糖醛酸(42.9%)和肽部分(1%),全面分析了聚糖的結構。黃偉等[41]利用水回流法提取出杜仲葉酸性多糖EOP-1,經柱層析梯度洗脫、乙醇沉淀、丙酮洗滌,獲得最佳脫蛋白、脫色方法為Sevage脫蛋白法和過氧化氫脫色法,利用高效凝膠滲透色譜分析發現多糖EOP-1主要有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,是一種酸性多糖,分子量約為6.0×105Da,是杜仲葉中首次發現的多分支酸性雜多糖。

安秋榮等[42]以乙醚、正己烷、NaOH甲醇溶液作為衍生劑,提取杜仲葉脂肪酸,毛細管氣相色譜-質譜測定出10種脂肪酸,分別為豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、十六烷酸、亞油酸、亞麻酸、花生酸、山崳酸、二十三烷酸、二十四烷酸,亞麻酸含量最高45.85%,豆蔻酸含量最低0.30%。

杜仲葉多糖的提取過程較為復雜,水提取回流法是常用提取方法,簡便易操作,重現性好,節約成本,用乙醇醇沉、硫酸鈉溶解沉淀,提取過程大致分為提取、過濾、離心、濃縮、沉淀、溶解等六個步驟,對于多糖的測量多采用色譜法,實驗流程操作快捷,結果精確。杜仲葉脂肪酸提取研究較少,仍需進一步的研究。

1.7 氨基酸

杜仲葉中含有15種氨基酸,游離氨基酸極少,主要包括蘇氨酸、蛋氨酸、精氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、谷氨酸等,其中精氨酸和組氨酸含量較高。

周芳等[43]使用GC-MS/SIM的方法測定杜仲葉中氨基酸的含量,鹽酸提取杜仲葉,提取液經BSTFA+1% TMCS衍生化后進樣,全掃描定性,使用內標法定量,實驗結果表明氨基酸線性關系良好,回收率較高,同時,測定4個產地杜仲葉中氨基酸的含量,共發現15種氨基酸,7種為人體必需的氨基酸,色氨酸由于在酸性條件下被破壞,未檢測出。Huang R H等[44]利用核磁共振波譜法測定了杜仲葉中提取物抗真菌肽(EAFP2)在水溶液中的三維結構,得出EAFP2是一種三級結構,包含一個域、一個疏水鍵和一個特色部分形成的氨基端殘留物和羧基端通過二硫鍵Cys7-Cys37交聯。

氨基酸的測定方法有很多,其中,電化學法具有干擾背景大、非電化學活性的氨基酸仍需進一步衍生化反應等缺點,氨基酸自動分析儀價格昂貴、實驗成本高,薄層色譜法定性定量不夠準確,因此實際應用受到限制,而本文提到的色譜質譜聯用法可以有針對性的選擇目標化合物,具有簡便靈敏、重現性好、準確度高等優點,適用于杜仲葉中氨基酸的分離檢測。

1.8 維生素、微量元素和其他成分

杜仲葉中含有豐富的維生素和胡蘿卜素,還含有維生素B2和微量的維生素B1,這與杜仲的抗衰老以及細胞免疫能力息息相關。杜仲葉含有15種礦物質元素,包括鋅、銅、鐵等微量元素和鈣、鉀、磷、鎂等宏量元素。杜仲葉中還含有其他成分,如地芰普內酯、酒石酸、β-谷甾醇、胡蘿卜苷等35種揮發性成分,還含有生物堿葡萄糖乙甙等。

林杰等[45]利用頂空固相微萃取法(HS-SPME)結合氣相色譜質譜聯用技術(GC-MS)分析了杜仲和杜仲葉中揮發性化學成分,從杜仲葉中分離出了40種化學成分,鑒定出19種,占揮發性成分總含量的94.72%,其中含量較高的為壬醛13.53%、1-石竹烯10.36%,具有抗炎、局麻等作用,醋酸含量為3.47%;從杜仲中分離出39種化學成分,鑒定出13種,占揮發性成分總量的96.83%,其中含量較高的為壬醛17.47%,葵醛8.85%,具有抑制細菌的作用,正戊醇含量為6.37%;二者共有的成分為壬醛、樟腦和己醛。杜仲葉中部分化學成分在杜仲中沒有發現,因此杜仲葉代替杜仲入藥時應慎重考慮。

2 展望

傳統多以杜仲樹皮入藥,造成了杜仲資源的破壞,通過對杜仲葉的研究,發現杜仲葉活性成分豐富,與杜仲樹皮具有相似的化學成分,有代替杜仲皮的潛力。近年來,研究者主要對杜仲葉活性成分的提取分離及藥理作用進行了深入研究,以本文綜述的杜仲葉綠原酸和黃酮為例,杜仲葉中綠原酸和黃酮含量高,提取分離方法多樣,同時具有良好的生物活性,可作為一種很好的天然植物活性成分來源,除此之外,杜仲葉中可提取利用的還有桃葉珊瑚苷、咖啡酸等多種成分,既發揮了杜仲葉含有的這些功能性成分的優勢,又充分利用了杜仲葉資源。

杜仲葉的資源十分豐富,但并未得到有效的開發利用,例如在臨床上的應用范圍較窄,很多試驗缺乏科學依據,且杜仲葉的成藥品種少,還未開發出更好的藥品,這就要求在未來的研究過程中將杜仲葉的藥理作用機制研究透徹,使其得到最大化的利用。筆者認為,對于杜仲葉的深度開發,有兩種發展趨勢。第一,可充分加工利用提取有效成分之后的杜仲葉殘渣,減少杜仲葉資源的浪費。第二,以杜仲葉為原料開發出具有保健功能的產品,例如杜仲茶、杜仲飲料等。同時,未來對于杜仲葉的研究應更加全面化、系統化、條理化,開發出更多的杜仲葉食品、保健品和藥品。