γ氨基丁酸改善睡眠作用機制的研究進展

李 科,俞蘭秀,劉小雨,劉 冬,張惟廣,*

(1.西南大學食品科學學院,重慶 400715;2.深圳職業技術學院應用技術研發院,廣東深圳 518055;3.綠雪生物工程(深圳)有限公司,廣東深圳 518105)

γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA)是一種廣泛分布于動、植物體內的小分子量非蛋白質氨基酸,分子式為C4H9NO2,分子量為103.12 Da,水溶性強,熱穩定性高,微溶于熱乙醇,不溶于乙醚等有機試劑,其晶體形態呈白色片狀或針狀[1]。GABA在溶液中常以兩性離子(帶負電荷的羧基和帶正電荷的氨基)形式存在,由于正負電荷基團間的靜電相互作用,使得GABA在溶液中能夠兼具氣態(折疊態)和固態(伸展態)時的分子構象,而GABA在溶液中多分子構象共存的形式,使其能夠結合多種受體蛋白并發揮多種重要生理功能[2]。Diana等[3]就不同食品中的GABA含量及其生理功能進行綜述,指出食用含有一定量GABA的茶葉、發酵乳、巧克力、小麥胚芽、發酵肉制品等食品,具備改善睡眠、改善抑郁、促進放松、改善炎癥、降血壓、提高免疫力、增加腦部蛋白分泌等多種生理功能。

大腦中GABA、褪黑素、谷氨酸等神經遞質的含量水平及其受體功能,對調節睡眠發揮著不同作用,當外源注入上述遞質時,能夠增加與該遞質相關的睡眠時相,同時這些神經遞質彼此緊密聯系,相互影響,共同維持著睡眠-覺醒行為[4-5]。人每天將近1/3的時間用于睡眠,良好的睡眠對緩解疲勞、維持身體健康發揮著積極作用,通常個體睡眠受其情緒狀態、年齡階段、生活習慣、勞動強度、藥物接觸等因素影響[6]。失眠是一種常見的睡眠障礙,其發生與軀體疾病、壓力、焦慮和抑郁狀態等密切相關[7]。常人受到壓力等應激源刺激時,其下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)活性增加,而長期的應激刺激,使得HPA軸活性持續異常亢奮,會導致機體出現抑郁或焦慮,進而誘發失眠[8]。研究發現,大腦中GABA含量水平的降低,與焦慮癥、抑郁癥、癲癇、帕金森等精神心理障礙或中樞神經系統疾病的發生存在一定關聯[9]。此外,GABA作為一種中樞神經系統抑制性神經遞質,能在GABA轉氨酶作用下,經由GABA旁路(GABA-shunt)進行分解代謝,而其中間代謝產物的γ-羥基丁酸(GHB),可通過作用細胞膜上的GHB特異性受體、GABA-B受體或5-羥色胺能神經系統等途徑,發揮對中樞神經系統興奮性神經元的抑制作用,進而對機體產生鎮靜催眠等效果[10]。

當前,GABA的食用安全性已獲得包括美國、日本在內等國家的廣泛認可,我國也于2009年,將其認定為一種新食品原料,并可用于飲料、糖果、巧克力等食品的生產[11-12]。相關研究[13-15]證實,外源攝入一定量的GABA具備改善睡眠的生理功效。本文綜述了GABA通過腸-腦軸、腦組織透性及其體內代謝物在改善睡眠方面的作用機制。

1 GABA通過腸-腦軸在改善睡眠方面的作用機制

腸-腦軸是腸道與大腦之間由神經通路、內分泌和免疫共同構成的一個復雜雙向信息交流系統,其雙向交流途徑涉及迷走神經途徑、神經內分泌途徑和免疫途徑[16]。

1.1 迷走神經途徑

相關研究[17]指出,通過刺激生物體迷走神經外周端(如經皮耳迷走神經電刺激),可提升其腦部GABA含量水平。并且迷走神經刺激術(transcutaneous vagus nerve stimulation,tVNS)對治療失眠、癲癇、抑郁等病癥具備一定效果[18-19]。在被喻為“第二大腦”的腸神經系統中含有4～6億個腸神經元,其中約20%的神經元為初級傳入神經元,這些神經元可通過迷走神經途徑,實現腸神經系統與中樞神經系統間信息的雙向交流[20-21]。實驗發現,在小鼠胃腸道迷走神經傳入神經元結狀神經節(nodose ganglion,NG)部位,編碼GABA-B型受體1(Gabbr1)的基因具有相對高水平的轉錄表達,因而能對GABA產生相應的信號感知,經迷走神經途徑上行傳遞后,影響大腦功能,發揮生理功效[22]。此外,還有研究表明GABA能夠作用腸嗜鉻細胞(EC細胞)并促使其分泌釋放5-羥色胺(5-HT),而5-HT在作用腸黏膜的迷走神經末梢的相應受體后,能對其放電活動產生刺激作用[23]。此外,刺激迷走神經,還能促進5-HT透過血腦屏障,提高中樞神經系統的5-HT濃度,而臨床上也常用5-HT再攝取抑制劑用于治療抑郁和改善睡眠障礙[19]。有動物研究[24]顯示,在給予小鼠喂食活性鼠李糖乳桿菌(JB-1)后,可通過迷走神經途徑,改善強迫游泳應激后小鼠的焦慮和抑郁樣行為,同時上調其腦部海馬區中GABA-A受體α2亞型的表達。大腦中,海馬等部位是參與情緒處理及認知的重要腦區,而GABA-A受體具備鎮靜安眠、抗焦慮等藥理作用,特別是在其α亞型等受體表面分布有巴比妥類或苯二氮卓類鎮靜催眠藥物的結合位點。臨床研究表明,焦慮、抑郁和失眠成正相關,三者常相伴存在,緩解機體焦慮和抑郁有助于改善失眠[25]。已知,包含短乳桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌等在內的多種乳酸菌能夠通過谷氨酸脫羧酶(GAD)途徑內源合成GABA[26]。有研究指出,鼠李糖乳桿菌(JB-1)也同樣具備GABA合成能力[27]。Janik等[27]利用磁共振波譜學技術(magnetic resonance spectroscopy,MRS)進行在體測定發現,在持續一月每日灌胃小鼠200 μL(含JB-1活菌數1×109CFU)活菌液后,喂食活性JB-1菌的小鼠腦部,其GABA含量由喂食前的(1.2±0.1) mmol/L增加至(1.5±0.2) mmol/L(p<0.01),提升了25%。雖然在動物實驗中展現了活性JB-1菌對模型小鼠具有良好的生理效果,但還無法明確其結果多大程度上源于該菌所產的GABA,因而后續可考慮以喂食滅活或經基因敲除GAD酶基因片段的活性JB-1菌作為對照。而有實驗[14]表明,在灌胃小鼠一定量的GABA和五-羥色氨酸(5-HTP)后,能極顯著的縮短小鼠睡眠潛伏期并延長總睡眠時間(p<0.01),并且由實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析得知,實驗組小鼠大腦皮層GABA-A受體轉錄水平高于對照組1.37倍。暗示外源攝入GABA可通過腸-腦軸中迷走神經途徑影響中樞神經系統中GABA含量水平及其受體表達,進而發揮其改善睡眠等功能[13]。

1.2 神經內分泌途徑

研究發現,外源攝入GABA能夠提高機體的抗應激能力,而機體長期處于應激狀態,會出現睡眠障礙、情緒異常等問題[28-29]。在外源應激刺激作用下,神經系統能夠影響內分泌系統的激素分泌,下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)是機體應答外源應激刺激的重要組成部分[30]。Gao等[31]發現,持續的應激會損害小鼠下丘腦室旁核(PVN)中GABA能系統對促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)相關神經元的抑制,而PVN中GABA-A受體的激活,可有效抑制HPA軸活性以及血漿皮質酮含量的上升。此外,腎上腺組織也有發現GABA-A亞型受體的存在[32]。據一項動物試驗結果顯示,外源攝入GABA能夠抑制應激后機體HPA軸活性以及CRH和糖皮質激素含量水平[33]。Farzi等[34]報道,生物體長期暴露于壓力等應激源刺激,會致其HPA軸活性持續異常亢奮以及血漿皮質酮含量異常升高,進而誘發焦慮或抑郁樣行為;此外應激所引發免疫系統炎性介質的產生,還會進一步刺激HPA軸活性的過度亢奮。前述提及的焦慮、抑郁和失眠常相伴發生,因而GABA能通過神經內分泌途徑緩解應激所致的焦慮或抑郁狀態,進而改善睡眠。

1.3 免疫途徑

人體內約70%的免疫細胞,分布于腸道相關淋巴組織(GALT),GABA作為一種有效的免疫調節分子,可作用腸道中不同免疫細胞的GABA受體,介導其炎性相關細胞因子的產生[35]。例如GABA可作用免疫系統中小膠質細胞的GABA-B受體或巨噬細胞的GABA-A受體,抑制其促炎性細胞因子(白細胞介素-12)的生成[23]。研究發現,GABA還能作用位于十二指腸、空腸等腸組織部位的GABA受體,改善炎性腸病[36]。據報道,機體炎癥反應所引發核轉錄因子NF-κB的激活,會抑制生物鐘系統內核心鐘組分Per、Cry等負調節基因的表達,損害生物鐘系統的周期性振蕩,致使生物體晝夜節律紊亂,從而擾亂其正常的睡眠-覺醒周期[37]。而GABA可通過免疫途徑,改善炎癥反應,降低促炎性細胞因子的生成及其對HPA軸的刺激,從而參與睡眠活動的調節。

2 GABA通過腦組織透性在改善睡眠方面的作用機制

經口攝入的GABA要到達中樞神經系統,首先需要由消化道進入血液循環。小腸是人體內實現營養物質消化與吸收的重要部位,其內皮細胞間存在與血腦屏障(blood brain barrier,BBB)中腦微血管內皮細胞間的類似緊密結構。但不同于后者的是,在小腸絨毛或隱窩部位的腸內皮細胞間,分別存在不同直徑的孔隙(0.4～0.9 nm;5.0～6.0 nm),一些親水性小分子物質可借此直接透過腸內皮細胞屏障[38]。相關研究[39-40]表明,在小鼠十二指腸、回腸等腸組織部位以及人腸上皮細胞模型Caco-2中均有GABA轉運蛋白的存在。林智等[41]利用14C放射性自顯影法研究GABA在小鼠體內的吸收,結果表明在對小鼠灌胃[14C]-GABA的60 min后,小鼠腦部區域即顯示有放射性信號的存在,暗示GABA可經胃腸道進入血液循環。同時一項關于GABA的人體試食實驗結果[13]顯示,在10名受試者經口攝入200 mg食品級GABA的30 min后,受試者血液中GABA平均濃度由攝入前的244 nmol/L顯著上升至329 nmol/L(p<0.05),由此進一步證實經口攝入的GABA可由生物體消化道進入血液循環。

在人腦部的血液和腦組織間,存在著血腦屏障(BBB)、血液-腦脊液屏障(BCSFB)和蛛網膜屏障的三類屏障[42]。其中最為重要的BBB是由腦微血管內皮細胞、星形膠質細胞等構成的一類動態屏障系統,其在保護中樞神經系統免受有毒物質侵害的同時,也成為了一些針對中樞神經系統疾病藥物或其它有益分子透入腦組織的障礙[42]。早期,Roberts等[43]將溶有75 mg GABA的生理鹽水(0.5 mL),經靜脈注入老鼠體內,通過在注射后的不同時間點對其腦組織取樣,進行紙色譜法分析發現,實驗鼠腦部GABA含量與對照組無顯著差別,由此推測GABA可能不具備BBB透性。Kuriyama等[44]則利用同位素標記法,將[3H]-GABA經腹腔注入小鼠體內,并以注入GABA轉氨酶(GABA-T)抑制劑氨基氧乙酸(AOAA)的小鼠為對照,結果表明在實驗組與對照組小鼠腦部均未發現[3H]-GABA的存在,從而認定GABA不具備BBB透性。然而,Boonstra等[11]指出,Kuriyama等[44]在實驗中使用的[3H]-GABA,因其分子結構上額外附加一個羥基,致使其結構異于GABA原結構。通常,物質結構的變化,會導致其理化特性或生理功能的改變,因而需進一步評估Kuriyam等在實驗中所用[3H]-GABA材料對其實驗結論的影響。有相關研究[45-48]也指出GABA具備BBB透性。如Li等[48]發現,在對大鼠靜脈注入50 mg/kg·bw劑量GABA的60 min后,實驗組大鼠腦內GABA濃度(474±33) μg/g顯著高于注入生理鹽水的對照組(p<0.05),同時注入GABA的大鼠還表現出鎮靜及困倦的行為效應。此外,L?scher等[49]還以犬為實驗對象,進行在體實驗發現,經靜脈注入犬體內的GABA,還可通過滲透其BCSFB進入腦脊液。

相較體內研究,體外BBB模型具備可控性強、效率高等優點,因而常選擇構建適宜的體外BBB模型,用于評估外源物質對BBB的透性。由于人源體外BBB模型的構建,受取材困難等限制,因而在實驗中多以鼠、牛等動物腦部為供源,用于構建體外BBB模型[50]。Takanaga等[45]報道,在鼠源永生化細胞體外BBB模型(TM-BBB)中存在一種GABA轉移蛋白(BGT-1,slc6a12),該蛋白可實現外源[3H]-GABA對模型細胞的胞內轉運。同時作者經RT-PCR及Western blot證實,BGT-1蛋白在鼠腦微血管內皮細胞也具有相同表達,即表明BGT-1蛋白可參與GABA對BBB的透入。此外,Kakee等[46]又以腦外排指數(BEI)和腦攝取指數(BUI)為指標,將[3H]-GABA顯微注射到大鼠大腦皮層頂二區,進行在體實驗,結果顯示[3H]-GABA可透過BBB實現腦組織與血液間的雙向轉運,并且其外排速率高于攝取速率的16倍。同時,作者也在永生化鼠源腦毛細血管內皮細胞系MBEC4中發現了BGT-1蛋白的表達。Uchida等[51]通過對5份人腦微血管樣本所含轉運蛋白的分析發現,BGT-1蛋白在人腦微血管中的平均含量為(3.16±0.94)fmol/μg·蛋白。雖然BGT-1(slc6a12)相對其它三種GABA轉運蛋白(slc6a1、slc6a11、slc6a13),對GABA的親和力最低(Km=80 μmol/L),其分布量在腦中也相對較少,但BGT-1在軟腦膜處卻具有相對高的表達量[52]。而軟腦膜處豐富的毛細血管,可與腦室管膜上皮細胞共同形成脈絡叢組織,由此或可解釋GABA透過BCSFB進入腦脊液的原因。BGT-1等GABA轉運蛋白還廣泛分布于星形膠質細胞,而作為BBB重要構成部分的星形膠質細胞,其可通過細胞終足,包裹約整個腦毛細血管表面,同時橋連神經元與突觸間隙[53-55]。研究[56-57]發現,星形膠質細胞在介導BBB透性、神經元興奮性和突觸傳遞的同時,還可參與腦與血液間的物質交換以及多種神經遞質(如GABA)的合成。由此,血液循環中的GABA可進入中樞神經系統,在結合相應受體后,參與對睡眠活動的改善。

鑒于對活性人腦微血管內皮細胞取材困難限制,對其所含BGT-1蛋白的深入研究,則可基于體外模型予以開展。由于物種差異,任何動物源體外BBB模型,都無法完全模擬在體條件下人BBB功能,而選擇構建人源體外BBB模型,更有益于研究外源物質對人BBB的透性。在現已構建的人源體外BBB模型中,以永生化人腦微血管內皮細胞系(hCMEC/D3細胞系)使用最廣,但該細胞系的屏障性能易受培養條件影響,在常規培養條件下難以對小分子物質進行有效阻隔[50]。為適應更高要求,因而需要開發構建新的的人源體外BBB模型。近年來,隨著干細胞技術的快速發展,現已可實現通過誘導多能干細胞(iPSC),用于人源BBB模型的構建[58]。由于現有人工操作誘導培養技術,難以實現對細胞誘導過程中的生理變化,進行實時動態把控,加之人工操作效率低等問題,制約了干細胞誘導分化的成功率和穩定性。幸運的是,借助我國中科院廣州生物醫藥與健康研究院自主研制的全自動干細胞誘導培養設備,則可實現多能干細胞誘導的全程自動化操作,在有效解決上述問題的同時,持續的為人源BBB模型的構建提供合格的誘導細胞。

3 GABA通過體內代謝物在改善睡眠方面的作用機制

外源攝入的GABA,在機體內可通過GABA旁路(GABA-shunt)進行分解代謝,其代謝產物之一的γ-羥基丁酸(Gamma -hydroxybutyrate,GHB),是一種具備BBB透性的水溶強效中樞鎮靜劑[59]。研究發現,患有睡眠障礙的個體在外源攝入低劑量的GHB后,能夠增加其夜間δ波睡眠、改善睡眠品質[60]。而GHB改善睡眠的作用機制與其作用GABA-B受體以及部分GABA-A亞型受體(如α4β1δ亞型)有關[61-62]。GHB與GABA類似,均以內源物形式分布于機體中,生理狀態下,GHB在人血液和腦內的cut-off值分別為4 mg/L和10 mg/kg[63-64]。GHB與GABA在一定條件下,可實現二者間的相互轉化。現已證實[65]在琥珀酸半醛脫氫酶(SSADH)缺乏癥患者體內,可由GHB轉化為GABA,但該轉化途徑是否同樣存在于生理狀態下的機體內,仍有待進一步研究。而有實驗[62]表明,在對小鼠腹腔注入高劑量GHB(300 mg/kg·bw)后,其腦內的GABA含量并未得以提升,同時作者還通過代謝組學分析發現,分布于肝臟的GHB可分別通過HOT酶或GHB還原酶分解為琥珀酸半醛(SSA),前者產生的SSA被代謝為4,5-二羥基己酸酯(4,5-dihydroxyhexanoate),后者產生的SSA則被氧化為琥珀酸,最后進入三羧酸循環。

當前,僅有少數文獻報道,經口攝入的GABA在體內與GHB之間的代謝轉化關系。據一項體內研究[41]顯示,在灌胃小鼠[14C]-GABA的1h后,其肝臟中[14C]-GABA和SSA的含量達到最高值,而GHB含量在灌胃3 h后才顯著升高。其原因可能在于:一部分SSA通過琥珀酸半醛還原酶轉變成了GHB;另一部分SSA則氧化成了琥珀酸[66],而當肝細胞中線粒體含有過量的GABA或GHB,且缺乏足夠供氧時,經GABA旁路產生的琥珀酸,會提高線粒體基質中總琥珀酸含量,進而促使由琥珀酸輔酶A連接酶催化生成ATP(或GTP)的可逆反應轉向逆反應方向進行,從而降低其底物水平磷酸化,由此也在一定程度上間接抑制了肝臟中GHB的分解。綜上GABA可通過其體內代謝途徑,間接參與睡眠活動的調節。

4 展望

GABA對睡眠障礙的改善功效,可能是基于其多途徑作用后的綜合效果。GABA作為一種水溶性小分子物質,其弱親脂性特點,限制了自身難以迅速透過血腦屏障,而需借助相關轉運蛋白(如BGT-1蛋白),透入腦組織。由于BGT-1蛋白對GABA的親和力較弱,當血液中GABA濃度過低時,其可能難以實現對腦組織的有效透入。前文所述,在人腦部血液和腦組織間,還可通過其他途徑進行物質交換,因而在后續研究中,可就機體血液中GABA含量水平及其腦組織透入方式與改善睡眠間的聯系進行深入探討。下丘腦視交叉上核(SCN)被視為哺乳動物的晝夜節律起搏器,而分布于不同SCN神經元的GABA能夠參與維持晝夜節律協調[67]。因此外源攝入GABA后,對睡眠障礙患者晝夜節律的影響,可能也是GABA對改善睡眠作用的潛在方式。

腸-腦軸是機體腸道和大腦間一個復雜的信息雙向交流系統,胃腸道是經口攝入GABA體內吸收的重要部位,因而GABA通過腸-腦軸,上行作用中樞神經系統,是其發揮睡眠改善作用的有效途徑,但兩者間深入的內在聯系還需進一步研究。研究顯示,宿主腸道微生物與其腸-腦軸間也存在著交互作用,而人體胃腸道中分布的微生物,其總數可達100萬億、種類近1000種[68]。近年來,持續的研究發現,腸道微生物的豐度及代謝活動對宿主胃腸道功能失衡、抑郁、焦慮和失眠等疾病的發生發展或預防治療具有重要影響[69]。有文獻[70]報道,GABA可作為生長因子,調控宿主腸道微生物的生長(如KLE1738菌),由于人體胃腸道中尚有23%～65%的物種仍未培養,因而GABA對這些微生物的生長代謝及其生物學功能的影響尚有待進一步揭示。