不同實驗室環(huán)境下ELISA法檢測血清GM結(jié)果的可靠性研究*

婁鑒芳，梅亞寧，張世昌，徐華國，王 加

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗學(xué)部，南京 210029)

半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)是一種多糖成分，以穩(wěn)定的形式存在于包括曲霉屬在內(nèi)的多種真菌細胞壁中。它在真菌感染如侵襲性曲霉病(IA)期間被釋放到循環(huán)血液中，并且現(xiàn)在被廣泛用于高風(fēng)險患者IA的早期檢測和診斷[1]。GM檢測為疑似真菌感染患者的早期鑒別和指導(dǎo)靶向抗真菌藥物給藥提供了一種方便的方法，即使在疾病進展之前，也可以降低發(fā)病率和死亡率。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)現(xiàn)在是用于檢測血液循環(huán)中GM抗原以快速診斷侵襲性真菌感染的常用檢測方法[2]。然而，各種影響因素可能導(dǎo)致GM檢測出現(xiàn)假陽性結(jié)果，例如同時使用某些抗生素、飲食因素以及與其他真菌或細菌的交叉反應(yīng)[3，4]，這些在最終結(jié)果解釋中都不應(yīng)被忽視。因此，根據(jù)制造商的建議和指示，應(yīng)該對初檢陽性樣品進行復(fù)檢以避免這些假陽性結(jié)果[5]。但由于GM檢測缺乏可重復(fù)性，并且在不同地區(qū)的ELISA靈敏度變化范圍較大(范圍從30%到100%)[6，7]，本研究我們決定探索影響我院GM檢測結(jié)果的因素。

1 材料和方法

1.1 實驗樣本材料 收集2016年6月～2017年4月在本院初診為疑似侵襲性真菌病的住院患者3 407例，1 167份血液樣本，排除使用某些抗生素及腸外營養(yǎng)的臨床影響因素。全血在3 000 r/min離心10 min分離血清，-4℃儲存，1周內(nèi)進行檢測。

1.2 試劑和儀器 試劑盒使用PlateliaTMAspergillus Ag試劑盒(美國Bio-Rad公司)，儀器使用Thermo scienrific MULTISKAN FC酶標(biāo)儀(上海Thermo Fisher儀器有限公司)，BD Phoenix-100全自動細菌鑒定儀(美國BD公司)等。

1.3 方法

1.3.1 GM檢測：采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)檢測樣本中的GM。首先，將300 μl血清與100 μl處理液混勻，在100℃加熱煮沸6 min，處理后的樣品10 000 r/min離心10 min以獲得上清液。將50 μl與酶結(jié)合的單克隆抗體(EBA-2)試劑和50 μl上清液依次加入微孔板中，然后混合。37℃孵育90 min后，將板洗滌至少5次，拍干，室溫下加200 μl底物溶液黑暗中孵育30 min。加100 μl 1.5 ml/dl硫酸溶液終止反應(yīng)，450 nm波長下讀取A值，其中參考波長為620 nm。其以樣品A值/臨界值A(chǔ)值的比率計算。ODI>0.5被認(rèn)為是陽性結(jié)果。

1.3.2 空氣培養(yǎng)及鑒定：將暴露于空氣中的三塊血瓊脂平板置于該空間對角線上5 min，其中一個在中間，另兩個分別在離地面1米高的距離內(nèi)墻1米的對角線的內(nèi)側(cè)和外側(cè)距離處。然后關(guān)閉這些平板并在溫度為37℃，含5 ml/dl CO2的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)48 h。48 h后觀察平板菌落生長情況并鑒定菌落。同時，挑取菌落以制備用于GM檢測的懸浮液(103/300 μl生理鹽水)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。檢測結(jié)果顯示為ODI，ODI值以中位數(shù)形式表示。配對t檢驗分析GM初檢和復(fù)檢吸光度指數(shù)(optical density index，ODI)均為陽性的結(jié)果。兩組間率的比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般環(huán)境下的GM檢測結(jié)果 ODI>0.5的所有血清樣本被認(rèn)為是檢測結(jié)果陽性。在3 407例樣本中，有191例樣本初檢為GM陽性，中位ODI為1.066。對191例樣本進行復(fù)檢發(fā)現(xiàn)115例樣本最終確證為陽性，中位ODI為1.204，這115例樣本兩次檢測的ODI(1.013 vs 1.204)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.940，P=0.384)。最終的陽性率為3.38%(115/3 407)。然而結(jié)合臨床癥狀、影像學(xué)檢查及最終培養(yǎng)結(jié)果，115例陽性病例中只有34例最終確診為IA，其他81例未確診為IA。在76例GM陰性病例中，56例未被鑒定為IA，20例確診為IA，故GM診斷的敏感度為63.0%(34/54)，而特異度為40.9%(56/137)。陽性預(yù)測值(PPV)為29.6%(34/115)。

2.2 嚴(yán)格控制環(huán)境下的GM檢測結(jié)果 在生物安全柜內(nèi)進行嚴(yán)格的紫外線滅菌及消毒措施，共檢測了1 167例樣本。結(jié)果顯示初檢和復(fù)檢陽性率分別為5.40%(63/1 167)和3.94%(46/1 167)。實際上，在46例陽性病例中有27例被診斷為IA，19例未被診斷為IA。在17例陰性病例中，10例未被診斷為IA，7例被診斷為IA。所以PPV為58.7%(27/46)，敏感度和特異度分別為79.4%(27/34)和34.5%(10/29)。

2.3 兩種不同實驗環(huán)境下的診斷參數(shù)比較 嚴(yán)格控制環(huán)境下GM試驗的敏感度高于一般環(huán)境下；與此同時特異度稍有下降，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。嚴(yán)格控制環(huán)境下，GM試驗的PPV明顯高于一般環(huán)境下(29.6% vs 58.7%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.85，P<0.001)。

2.4 由非樣本因素引起的檢測結(jié)果假陽性 空氣培養(yǎng)的微生物鑒定結(jié)果顯示，環(huán)境中出現(xiàn)的隨機空氣污染主要以枯草芽孢桿菌、曲霉菌、毛霉菌等微生物為主。制備相應(yīng)的細菌懸浮液進行GM檢測時，我們發(fā)現(xiàn)曲霉菌屬顯示強陽性結(jié)果，ODI為11.397；毛霉菌屬顯示中等強度陽性結(jié)果，ODI為6.412；枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出輕度陽性，ODI為0.734。

3 討論

在此次的研究中，我們發(fā)現(xiàn)GM檢測診斷侵襲性曲霉菌感染的敏感度為63.0%，特異度為40.9%，就此次結(jié)果來看本院GM檢測的敏感度和特異度均低于其他發(fā)達國家[8]。而采用嚴(yán)格控制檢測環(huán)境的措施后，我們發(fā)現(xiàn)敏感度和陽性預(yù)測值出現(xiàn)不同程度增高。初檢和復(fù)檢均為陽性的標(biāo)本顯示其兩次檢測結(jié)果并無明顯差異且均大于1.0，提示GM以O(shè)DI值1.0作為Cut-off值時，真陽性標(biāo)本所受到的影響較小。由于復(fù)檢后發(fā)現(xiàn)39.8%(76/191)初檢陽性標(biāo)本顯示為陰性，我們嘗試探討了導(dǎo)致出現(xiàn)這些情況的可能因素。考慮到GM用于檢測侵襲性曲霉病，我們懷疑環(huán)境中某些微生物的存在可能會影響結(jié)果，因此我們決定對檢測環(huán)境進行空氣培養(yǎng)。空氣培養(yǎng)的結(jié)果表明，GM檢測室中隨機空氣污染主要包括以下三種微生物污染：曲霉菌屬孢子、枯草芽孢桿菌和毛霉菌。以三種菌落分別制成細菌懸液進行GM檢測，結(jié)果表明GM檢測中的假陽性結(jié)果可能與檢測環(huán)境中這些微生物隨機空氣污染有關(guān)，這幾種微生物或由于與目標(biāo)檢測物相同或由于存在交叉反應(yīng)的抗原而導(dǎo)致了事實上的假陽性。與Cabana等[9]的研究結(jié)果不同的是，較低濃度即可引起這種陽性結(jié)果。

而后為了確定臨床上GM檢測的假陽性是否為隨機空氣污染所導(dǎo)致，共1 167例樣本在嚴(yán)格的無菌條件下進行了初檢和復(fù)檢，用以評估不同檢測環(huán)境條件下陽性率的變化。我們發(fā)現(xiàn)嚴(yán)格環(huán)境初檢陽性率低于普通環(huán)境中的初檢陽性率。同時，嚴(yán)格環(huán)境下最終的陽性率為3.94%，高于普通環(huán)境中的3.38%，這表明在嚴(yán)格環(huán)境下的假陽性率可以降低，并且提高最終的真陽性率。兩種不同環(huán)境條件下的PPV之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(29.6% vs 58.7%)，(χ2=11.85，P<0.001)，敏感度(63.0% vs 79.4%)也出現(xiàn)不同程度升高。因此，由于污染微生物的存在，檢測環(huán)境的不徹底消毒滅菌及影響因素控制可能會影響GM的初始結(jié)果的判定。

目前臨床上報道的絕大多數(shù)假陽性結(jié)果是由于應(yīng)用營養(yǎng)補充劑和/或一些血液系統(tǒng)疾病行骨髓移植后出現(xiàn)[10]，僅有一篇報道提示有操作以外的影響因素[11]，尚未出現(xiàn)本篇從操作環(huán)境的影響因素進行探討的類似報道。盡管ELISA實驗操作對于環(huán)境并沒有嚴(yán)格特殊的要求，但考慮到待檢物質(zhì)的特殊性，我們建議GM檢測應(yīng)該盡量在完全消毒滅菌的環(huán)境中進行。例如在生物安全柜或一定級別的生物安全室，檢測前后采用紫外線照射及相關(guān)消毒滅菌措施。而最終為了排除空氣中非樣品因素的輕微影響，GM結(jié)果仍應(yīng)與其他曲霉菌相關(guān)的標(biāo)志物結(jié)合用來對疾病的診斷和病情監(jiān)測進行判斷，這樣會協(xié)助得出更好更可靠的結(jié)論[12]。