植物葉發育分子遺傳機制的研究進展

楊會，曾紅霞，張娜，任儉，湯謐，李煜華，陳偉，熊建順，孫玉宏

（武漢市農業科學院，430345）

葉片是植物進行光合作用、呼吸作用及蒸騰作用的主要場所和重要器官，直接影響糖分的積累，其與植株生長勢、營養供應、產量、品質、抗性等密切相關[1～3]，且葉片的形態結構在植物逆境脅迫應答中具有重要作用。高等植物成熟葉片是由葉原基頂端分生組織周圍區起始，在一系列基因精確調控下，建立近-遠軸（離植物莖稈較近的一面為近軸，離植物莖稈較遠的一面為遠軸）、基-頂軸（葉片基部葉柄到葉片的尖端）和中-側軸極性（葉脈中軸指向葉片邊緣的結構），朝著特定的方向分裂和分化而形成。葉片發育過程除受遺傳因子調控外，還受光照、溫度和水分等外部環境因素的影響[4，5]。植物葉片形狀多樣化，但無論是單葉還是復葉，其形態建成都包括葉原基的發育、葉片極性的建立、葉片大小和葉形的調控。

1 葉原基的起始發育

葉發育起始于莖頂端分生組織 （shoot apical meristem，SAM），是植物葉片形成發育的初早期階段。通過對擬南芥、金魚草和玉米等的一系列研究，人們揭示了葉原基在SAM周圍區發育的機制，主要是很多重要的功能基因相互協調表達共同調控的作用[6]。生長素主要是通過輸入載體AUXI（Auxin Resistant）和輸出載體 PIN1（Pin-For-Med1）對其極性運輸進行調控，在葉發育起始部位SAM周圍區聚集著高濃度的生長素，通過抑制KNOX基因的活性進而促進葉原基發育[7～9]。

KNOX基因是頂端分生組織功能中重要的調控因子。KNOX1基因的高表達，可維持SAM處于分生組織形態，是SAM的特征之一。STM（SHOOT MERISTEMLESS）的stm突變體，SAM停止生長，但是能夠從愈傷組織或SAM部位中形成葉片[10]。ARP基因中的PHAN、RS2（ROUGH SHEATH 2）和AS1（ASYMMETRICLEAVES 1）通過抑制KNOX基因的表達，參與調控葉原基的起始發育。AS1基因表達于葉片表皮細胞和莖頂端分生組織，當AS1基因功能缺失時，葉片的發育則出現各種形態效應[11]。另外，KNOX1通過IPT7正向調控細胞分裂素的合成，并通過抑制GA20ox的活性負調控赤霉素的生物合成，從而調控細胞增殖和分化的進程，形成新器官[8]。

2 葉片極性的建立

葉片在基因和環境因子的協調作用下，形成近-遠軸、基-頂軸和中-側軸極性3個不對稱軸的過程，即葉片極性的建立[12]。

近年來，葉片的近遠軸性成為研究的熱點。該研究最早見于 1998 年，Waites等[13，14]從金魚草（Antirrhinum majus） phantastica（phan）突變體中克隆分離出與葉軸面分化相關的編碼MYB類蛋白的基因PHAN。研究表明，HD-ZIPⅢ基因家族中的PHB、PHV和REV基因，相互協調共同調控SAM細胞分裂向近軸面表達分化[15，16]。擬南芥AS1和AS2基因與金魚草中的PHAN基因同源，其中AS1在葉近軸面表達，AS2則在葉近、遠軸面交界的內側表達[12]。在葉遠軸化的發育過程中，KANADI基因家族、YABBY基因家族、AUXIN RESPONSIVE FACTOR（ARF）和miRNA165/166起著重要的作用。KAN基因家族中有4個功能冗余基因 （KAN1～KAN4），只有KAN1、KAN2和KAN3參與調控葉遠軸面的發育過程[17，18]。KAN家族基因單缺突變體，缺陷表型表現無或不明顯；而kan1 kan2雙缺突變或kan1 kan2 kan3三缺突變體，缺陷表型為明顯的遠軸特性[19，20]。擬南芥中有6個YABBY基因，其中只有FIL、YAB2、YAB3和YAB5在葉原基遠軸面和葉片邊緣區進行表達[21]。

葉片極性建成過程中，基因之間存在協同促進作用和拮抗作用。參與調控遠軸化的KAN基因與決定近軸化的HD-ZIPⅢ基因形成負反饋調節[22]，KAN1還通過與AS2基因中含有KAN1轉錄因子的保守結合位點直接結合，進而抑制AS2基因在遠軸面的表達[23]。AS1/AS2既可正向調控HD-ZIPⅢ，又可負調控YAB[12,24]。KAN和ARF可正調控YAB，YAB亦能反饋促進KAN和ARF表達[20，25～27]。 異位表達miR165/166能抑制近軸面基因HD-ZIPⅢ，使葉片發生遠軸化[28]。AEGONAUTE10（AGO10）與miR165/166-HD-ZIPⅢ基因的極性分布有關，可特異性識別結合miR165/166，并行使其抑制功能，從而參與調控葉片極性建成[29]。擬南芥Ta-siRNA中TAS3編碼產生的tasiR-ARF可直接負調控ARF3和ARF4基因[30]，且AEGONAUTE1（AGO1）也可通過作用于miR165/166，對HD-ZIPⅢ轉錄物降解進行調節，從而負調控HD-ZIPⅢ家族基因的表達，改變葉的軸性[31]。

3 葉片大小的調控

葉片的大小與細胞增殖與擴大的能力有關，受植物激素、TCP基因、GRF基因、miR396等調節因子的影響。

植物激素中的生長素、細胞分裂素、赤霉素和脫落酸，均可影響植物葉大小發育。生長素能誘導AUXIN-REGULATEDGENEINVOLVEDIN ORGANSIZE（ARGOS）基因的表達。擬南芥中，ARGOS基因的表達水平改變，會直接影響葉的大小；ARGOS基因過表達時可以葉片變大，下調時葉片則會減小[32]。綠蘿同時施用生長素和細胞分裂素時，能夠增加其葉片的厚度和葉肉層，研究表明，細胞分裂素的調控途徑可能與生長素調控植物葉生長的途徑類似[33]。赤霉素通過GA20ox1的作用影響葉大小，ga20ox1突變體相較于野生型而言葉面積明顯減少，而擬南芥aba2突變體與野生型相比，細胞數量減少，葉片顯著變小[34]。

TCP基因家族參與葉發育途徑的調控，對細胞的增殖與分化發揮著重要作用。根據保守結構域的差異，TCP蛋白分為2類：Ⅰ類，促進細胞增殖和植物生長，如水稻OsTCP12；Ⅱ類，抑制細胞增殖，如水稻OsTCP1[6]。

在擬南芥GRF基因家族中有9個成員，它們通過冗余的方式調控細胞增殖促進葉的生長發育。過表達GRF1和GRF2表現為葉顯著增大，而GRF1/2/3三突變體表現為葉明顯變小[35]。過表達GRF5促進細胞數目增多[8]，在ans突變體中，GRF5被下調，過表達AN3細胞數目增多、葉片增大，而ans缺失時會減緩細胞增殖速率[36]。

在擬南芥和水稻的葉發育過程中，miR396負調控TCP4和GRF的表達，而miR319抑制TCP4的表達[37，38]。

4 葉形的調控

植物葉形的豐富多樣性，主要體現在葉邊緣形態的多樣性，可分為全緣、鋸齒狀、不同程度和不同形狀的缺刻等。葉形性狀是在復雜的基因網絡調控作用下形成的，涉及眾多因子。

在生長素輸出途徑中，生長素的流動積累方向與PIN1在細胞膜上的極性定位方向一致，并在生長素高濃度匯聚點形成了葉齒[39，40]。研究發現，矮牽牛 （Petunia hybida）中的一類轉錄因子NAM（NO APICAL MERISTEM）能夠調控PIN1的極性定位，進而參與決定植物葉緣形態的建成[41]。CUC1（CUPSHAPED COTYLEDON 1）和CUC2（CUP-SHAPED COTYLEDON 2）為擬南芥中NAM的直系同源基因，CUC3則為旁系同源基因，其中CUC2決定葉片發育早期齒的形成，CUC3維持和保證齒的生長發育，即兩者均在葉齒之間凹陷處表達，而CUC1則對葉緣不起調控作用[42～46]。在葉發育過程中，MIR164對CUC2的表達量進行負調控，從而影響葉緣形態的建立。在擬南芥的miR164突變體中，降低miR164表達量時，CUC2表達量反而升高，此時葉片缺刻加深[44]；過表達MIR164時，CUC2表達量反而降低，此時葉片為全緣葉[47]。

KNOX家族基因對植物葉緣形態發育起著非常重要的調控作用。具有全緣無缺刻葉的擬南芥中，未發現KNOX1基因表達；而在很多具羽狀復葉或缺刻葉的物種，葉片中均可檢測到KNOX的表達[48～50]。研究表明，KNOX基因表達異常時能引起葉緣形態的強烈變化。在擬南芥La突變體和中as1突變體均發現KNOX基因過表達時，葉緣缺刻會增多；在碎米芥中過表達KNOX基因時，小葉增加，而降低STM（KNOX基因家族成員）表達量時，抑制小葉發育，嚴重時形成單葉[9,51，52]。 另外，KNOX基因以負調控赤霉素的合成基因或促進細胞分裂素生物合成的方式，調控激素之間的平衡，進而控制葉緣形態的發育[51，53]。 研究發現，JLO（JAGGED LATERAL ORGANS）、JAG（JAGGED）、SAWTOOTH和Tf（Trifoliate）等也可通過KNOX途徑影響葉緣形態發育[54]。

5 研究展望

近年來，隨著對擬南芥葉片發育研究的不斷深入，初步得到葉發育過程的調控網絡。植物葉發育是一個有序而復雜的過程。目前，對葉片的近遠軸性的研究較為深入，而葉片極性建立中的中邊軸性和基頂軸性的建立均有待深入的研究。植物葉片的多樣性和唯一性與環境息息相關，即使是同一植物其葉片也有可能存在很大差異。以葉片為經濟性狀的植物，葉片的優質高產，是該植物育種的主要目標；另一些植物，可以通過改變葉片形狀、著生角度等調整株型，提高光能利用率，從而達到高產的目的。因此，運用現代分子生物學、基因組學、生物信息學等手段進一步深入研究葉發育分子遺傳機制，不僅能完善葉發育的調控網絡，還能在植物育種上開辟新的方式。