植入前遺傳學檢測技術在單基因病和染色體平衡易位中的應用進展

史達源，徐家偉，孫瑩璞

(鄭州大學第一附屬醫院生殖醫學中心，河南省生殖與遺傳重點實驗室，鄭州 450052)

遺傳性疾病是導致新生兒出生缺陷的重要原因之一，目前部分遺傳病缺乏有效的治療方法。《中國出生缺陷防治報告2012》[1]指出，我國出生缺陷發生率約為5.6%，每年新增出生缺陷約90萬例，包括單基因病和染色體病的新生兒，給患者家庭造成了極大的負擔。近年來，植入前遺傳學檢測(preimplantation genetic testing，PGT)技術的發展逐步應用于單基因病、染色體病等遺傳性疾病的預防，為高齡和反復流產的患者帶來了希望，通過對植入子宮前的胚胎進行遺傳學檢測，選擇不攜帶致病基因和異常染色體的整倍體胚胎移植，能夠提高IVF患者的妊娠率，阻斷遺傳性疾病向子代傳遞。

一、PGT技術的進展

1990年國際首例PGT試管嬰兒誕生[2]，標志著試管嬰兒技術出現突破性進展，遺傳病患者可以生育健康后代。早期，針對遺傳病和反復不孕患者的PGT分為兩部分：植入前遺傳學診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)和植入前遺傳學篩查(preimplantation genetic screening，PGS)[3]。PGD適用于單基因病和染色體病的患者，PGS適用于女方高齡、反復流產、反復種植失敗和嚴重男性因素不育的患者。2017年，國際輔助生殖技術監控委員會對PGT進行了新的分類，包括三部分：植入前胚胎單基因遺傳學檢測(PGT for monogenic/single gene defects，PGT-M)、植入前胚胎染色體結構變異遺傳學檢測(PGT for chromosomal structural rearrangement，PGT-SR)和植入前胚胎非整倍體遺傳學篩查(PGT for aneuploidy，PGT-A)[4]。單基因病患者攜帶的致病基因遺傳給子代，會導致子代患病，加重家庭負擔。PGT-M可以篩選出不攜帶致病基因的胚胎用于移植，獲得健康后代。易位、倒位、重復、缺失等染色體結構異常的患者會形成染色體核型不平衡的配子和胚胎，導致胚胎反復種植失敗和早期流產[5-6]。PGT-SR可以發現胚胎的拷貝數變異(CNV)，移植不攜帶缺失和重復的整倍體胚胎。非整倍體作為人類胚胎中最常見的遺傳學異常，是導致早期流產最常見的原因之一[5，7]。對于接受IVF助孕的患者，PGT-A尤其適用于女方高齡、反復流產、反復種植失敗和嚴重男性因素不育的患者[3]。

隨著PGT技術的發展，檢測準確性不斷提高，患者的臨床結局獲得改善。早期，通過熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)進行PGT-A，評估染色體整倍性，但由于其檢測染色體數目有限和卵裂球活檢對胚胎的影響，未能改善IVF結局[8]。定量聚合酶鏈式反應(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)在4 h內快速檢測24條染色體的整倍性，可在同一周期行新鮮胚胎移植[9]。近年來，單細胞全基因組擴增技術的發展可以對24條染色體進行全部染色體篩查(comprehensive chromosome screening，CCS)。微陣列比較基因組雜交(array comparative genomic hybridization，aCGH)技術可檢測全部染色體的非整倍體和大于10 Mb的非整倍體片段[10-11]。單核苷酸多態性微陣列(single nucleotide polymorphism array，SNP array)芯片覆蓋了基因組上約300 000個SNPs位點，能檢測全部染色體的拷貝數變異、微重復微缺失、單基因病和單親二倍體[12-13]。二代測序(next generation sequencing，NGS)技術因其高通量、低成本、邊合成邊測序等優勢被廣泛應用，能檢測全部染色體的非整倍體、嵌合體、基因組和線粒體拷貝數變異、單基因病[14]。

目前廣泛使用的PGT技術存在一定局限性。單細胞全基因組擴增(whole genome amplification，WGA)由于起始DNA量少，可能引起等位基因脫扣(allele dropout，ADO)，雜合子中的一個等位基因擴增失敗，導致該位點被錯誤檢測為純合子，影響診斷準確性。染色體相互易位和羅氏易位是引起出生缺陷、不孕和反復流產的常見原因。CCS技術可以檢測全部24條染色體整倍性，但無法區分正常核型與攜帶染色體易位的整倍體胚胎。移植易位攜帶狀態的胚胎會使子代同樣遭受反復流產和不孕的風險。針對以上問題，近來有新技術方法能夠減少誤診、提高診斷準確性。

二、PGT技術在單基因病阻斷中的應用

目前已知有7 000多種單基因遺傳病，超過一半有明確的致病基因[15]。大部分單基因病會導致先天畸形、疾病或死亡，給患者家庭和社會醫療保健系統帶來沉重負擔。罕見病是一類嚴重影響人類健康的疾病，80%由于基因缺陷導致[16]，具有基因缺陷的罕見病患者通過PGT-M可以獲得健康后代。1990年第一例PGT-M通過擴增Y染色體特異性重復序列，移植不包含Y染色體的胚胎，避免了X連鎖隱性遺傳病患者生育患病子代[2]。自PGT-M誕生以來，經歷了20多年的臨床應用，成功阻斷了杜氏肌營養不良、苯丙酮尿癥、多囊腎、Alport綜合征等多種單基因疾病向子代傳遞。近年來，單基因病檢測技術不斷提高，能準確識別攜帶致病基因的染色體，并檢測拷貝數變異。

1.Karyomapping技術識別攜帶致病基因的染色體：WGA的局限性之一是ADO。Karyomapping技術通過對雙親、待測胚胎和患病親屬DNA進行SNP分析，能夠檢測遺傳物質的親本來源[17-18]，有效降低了ADO導致的誤診。該技術首先要尋找親本中攜帶者為雜合、另一方為純合的有效SNPs，然后與患病親屬的SNPs進行比較，確定攜帶致病突變的單體型。最后，根據胚胎中SNPs，篩選出不攜帶致病突變的胚胎用于移植。

該技術的優勢在于，能同時診斷單基因病和胚胎非整倍體，已成功應用于多種遺傳病的植入前診斷，并獲得健康新生兒[19-20]。然而，Karyomapping技術存在一定的局限性：需要患病親屬的DNA樣本進行連鎖分析；如果突變基因附近發生染色體重組，可能會導致SNP位點失效；對于近親結婚的患者，需要結合傳統PCR技術進行驗證。

2. 非整倍體測序與連鎖分析(mutated allele revealed by sequencing with aneuploidy and lingkage analyses，MARSALA)同時檢測單基因病和胚胎非整倍體：MARSALA是Yan等[21]研發的一種基于二代測序的PGT技術，能同時檢測單基因病和染色體異常，并進行連鎖分析。該技術將囊胚滋養外胚層活檢細胞通過多次退火環狀循環擴增技術(MALBAC)進行全基因組擴增，然后針對基因突變區域進行特異性擴增，運用低測序深度(0.1-2X)的二代測序準確檢測染色體整倍性和單核苷酸變異。目前，MARSALA技術已成功應用于常染色體顯性、隱性遺傳病和X連鎖遺傳病患者，并且獲得了不攜帶致病基因的健康新生兒[22]。

Wu等[23]在經典MARSALA的基礎上，對多個單精子進行全基因組擴增，3X測序深度尋找有效SNP進行連鎖分析，無需特定引物和患病家庭成員的檢測。運用單精子連鎖分析，該團隊為β地中海貧血相關基因HBB均為雜合突變的夫婦移植了不攜帶突變的整倍體胚胎，獲得了臨床妊娠，并且羊水檢測證明了該技術的準確性。傳統的NGS技術檢測點突變需要30X測序深度。MARSALA技術使用低測序深度能同時檢測非整倍體和突變位點，測序成本低，但該技術無法檢測新發突變。

3.qPCR特異性檢測突變位點：TaqMan qPCR為基礎的PGT技術，成本低，可以廣泛應用，且其可同時檢測單基因病和非整倍體，能夠在4～6 h內完成檢測，因此患者可以在子宮內膜容受性移植窗內進行新鮮胚胎移植。該技術具有極低的ADO發生率和極高的結果一致性，無需進行全基因組擴增，使用TaqMan探針通過位點特異性擴增可以直接靶向檢測突變位點。

有研究運用TaqMan qPCR對43例單基因病患者的304枚胚胎進行PGT，篩選出39枚不攜帶致病基因的整倍體胚胎進行移植，最終有27位患者成功分娩[24]。然而，脆性X綜合征和亨廷頓舞蹈病等疾病存在三核苷酸重復，無法通過qPCR基因型探針直接檢測突變，需要對患者家系突變基因附近的SNPs進行連鎖分析。對于TaqMan qPCR可以直接檢測的突變，連鎖分析可以避免ADO造成的誤診。

4.長讀長測序(long read sequencing)在長片段結構變異的單基因病中的應用：目前，通常使用全外顯子組測序(WES)或全基因組測序(WGS)檢測單基因遺傳病的突變位點，但由于模板DNA捕獲效率不足、測序覆蓋偏倚等問題，某些結構變異未被發現。Miao等[25]通過Nanopore全基因組長讀長測序技術，發現了WES短讀測序未能捕獲到的G6PC等位基因上的7.1 kb雜合缺失，結合WES檢測到的另一個等位基因上的點突變，鑒定出患者家系常染色體隱性遺傳方式的糖原貯積病Ia型的發病原因和致病基因來源。聯合定量PCR和微衛星連鎖分析，篩選出僅攜帶母源點突變的胚胎進行移植，成功分娩了一個健康女嬰。

長讀長測序技術，具有超長讀長、極低GC偏好性等優勢，可以精確檢測結構變異、串聯重復序列，彌補了短讀測序的不足[26-27]。雖然長讀長測序技術檢測時間長、成本高，但對于人類基因復雜序列拼接和致病性的人類基因組結構變異檢測有巨大潛力，可有效阻斷單基因病和復雜結構變異向子代傳遞，在未來PGT中有重要發展前景。

三、PGT技術在染色體平衡易位胚胎識別中的應用

染色體平衡易位在人群中的發生率約為0.2%，絕大部分因染色體組成未改變而表型正常，少部分易位染色體的斷裂破壞了基因功能，導致不孕、疾病綜合征和先天畸形。減數分裂時期，易位染色體分離紊亂，產生約70%不平衡配子，導致反復流產或新生兒染色體異常。運用斷裂區域DNA探針的FISH技術和短串聯重復序列(short tandem repeats，STR)單體型分析可以鑒別易位攜帶者，但無法進行全部染色體篩查[28]。對于反復流產和希望生育染色體核型正常后代的患者，尤其需要能區分易位攜帶狀態和正常胚胎的PGT技術。

1. 顯微切割和二代測序(MicroSeq)準確檢測染色體易位斷裂點：Hu等[29]使用激光顯微切割技術識別易位斷裂點及其連鎖的SNPs位點，建立了一種能夠精準定位染色體平衡易位斷裂點的方法，篩選出正常胚胎并成功應用于PGT。該技術能夠對易位附近的重排染色體進行顯微切割和二代測序，通過靶向PCR和Sanger測序精準檢測斷裂點及附近SNPs，利用有效SNPs進行連鎖分析，篩選出不攜帶染色體易位的正常胚胎。然而，該技術需要高度特異性的設備和復雜的樣本制備程序，難以應用于高通量的臨床檢測。

2. 等位基因映射識別技術(mapping allele with resolved carrier status，MaReCs)在染色體平衡易位胚胎識別中的應用：MaReCs是一種以NGS為基礎的方法，運用連鎖分析識別與易位相關的等位基因，能夠鑒別易位攜帶狀態的胚胎[30]。該技術運用MALBAC和NGS對活檢細胞進行全基因組擴增和測序，通過拷貝數變異識別染色體非平衡胚胎中發生易位的斷裂點，在斷裂點附近1 Mb區域的SNPs用于分析胚胎是否攜帶染色體易位，并篩選出正常胚胎用于移植。

使用MALBAC-NGS能將斷裂點檢測的準確性提高到200 bp，將SNPs的檢測范圍縮小到斷裂點附近約1 Mb區域，降低了因染色體重組而導致誤診的風險。目前該技術已廣泛應用于臨床，保證了染色體平衡易位患者胚胎的有效篩選。由于檢測需要非平衡的異常胚胎作為對照尋找斷裂位點，因此該技術具有一定局限性。

3. 植入前遺傳學單體型分析(preimplantation genetic haplotyping，PGH)在染色體平衡易位胚胎識別中的應用：近來有團隊通過SNP基因型構建斷裂區域單體型，從而識別不攜帶易位的正常胚胎。Wang等[31]使用Illumina Human Cyto-12芯片檢測基因組SNPs，將攜帶易位的非平衡胚胎作為參照，通過 SNP單體型分析識別出羅氏易位攜帶狀態的胚胎，移植了染色體正常的胚胎，并獲得臨床妊娠。Zhang等[32]利用SNP微陣列技術成功鑒別了平衡易位和羅氏易位攜帶狀態的胚胎。該技術的優勢在于，能夠同時篩查染色體易位和23對染色體拷貝數變異；適用于全部染色體的相互易位和羅氏易位。由于該技術使用的芯片僅有300 000個SNPs位點，因此檢測結果不能排除染色體重組的可能性。

BasePhasing是Zhang等[33]的團隊最近報道的一項能夠有效識別染色體平衡易位的技術。該團隊使用Infinium Asian Screening Array-24 v1.0(ASA)芯片及優化的分析流程，對兩例染色體平衡易位患者的胚胎進行了檢測，通過羊水穿刺細胞遺傳學分析證明了其技術的有效性。由于該芯片包含700 000個SNPs位點，因此斷裂區域內的有效SNPs數目較多，可以較好的排除染色體重組的影響。

4.配對二代測序和PCR斷點分析技術有效檢測染色體易位斷裂區域：Wang等[34]使用長范圍配對測序的方法識別平衡易位斷裂區域，獲得了染色體核型正常的新生兒。該策略首先通過配對測序檢測出包含斷裂點的5 kb片段，進行巢式PCR和Sanger測序，精確檢測出兩個斷裂點及其鄰近序列。然后，對胚胎的活檢DNA進行特異性PCR，并進行Sanger測序確認是否存在斷裂點。

該方法無需參照，但存在幾點局限性：首先，盡管測序深度高(30X)，但在11個相互易位患者中有2個未檢測到斷裂點；羅氏易位的斷裂點往往位于高度重復的著絲粒區域而不易檢測。第二，位于AT富集區域的斷裂點因缺乏有效的PCR引物而無法檢測；小片段缺失、插入或重復導致斷點附近序列改變，使PCR引物無效。因此，明確斷裂點之間額外的序列可以增加引物設計的準確性。第三，由于起始DNA量少導致ADO，可能會使易位攜帶狀態的胚胎誤診為正常胚胎。為了提高準確性，可以同一斷裂點使用兩對特異性引物來降低ADO的發生率。

四、展望

PGT誕生20多年以來，在單基因病、染色體病和非整倍體檢測等方面廣泛應用，阻斷致病基因和異常染色體向子代傳遞，篩選整倍體胚胎用于移植，改善了IVF患者的臨床結局。隨著SNP芯片技術的改進，基因組SNP檢測位點增加，診斷準確性提高[33]。全基因組范圍內的SNP連鎖分析可以確定染色體親本來源，能夠識別攜帶致病基因或平衡易位的染色體，具有廣泛的臨床應用價值。三代測序具有超長讀長、單分子測序的優勢，目前已經有成功檢測單基因病和染色體平衡易位的報道[25-26，35]。今后，在優化檢測流程和更新測序儀器的基礎上，三代測序可以為單基因病和染色體平衡易位患者提供低成本、準確有效的PGT。目前，PGT仍然存在ADO、擴增偏倚、胚胎嵌合體和外源性DNA污染等問題。因此，需要更加便捷有效和能廣泛使用的技術應用于PGT，縮短患者等待時間，降低成本，提高檢測準確性，改善臨床結局。