絕經后婦女骨密度和血清骨轉換指標與骨橋蛋白水平的相關性研究

王健 陳瑤 黃培基 劉曉紅

1. 福建醫科大學附屬協和醫院，內分泌科，福建 福州 350001 2. 福建省內分泌研究所，福建 福州 350001

前言

絕經后骨質疏松癥(PMO)是由于雌激素缺乏誘導的骨吸收超過骨形成而引起的全身骨骼疾病，其特征在于骨微結構的系統性破壞導致脆性骨折[1]。由于雌激素缺乏誘導破骨細胞活性增加而導致的骨吸收過多[2-3]。因此，抑制破骨細胞生成是絕經后婦女預防和治療骨質疏松癥的首選策略。先前的研究表明，骨橋蛋白(OPN)是抑制成骨細胞增殖和促進破骨細胞分化的重要調節因子[4-5]。OPN在骨中的作用已被證實，OPN缺陷小鼠對由卵巢切除術引起的骨質流失具有抵抗能力[6-8]。更重要的是，OPN缺陷小鼠可以挽救去卵巢誘導的破骨細胞募集和增加的RANKL表達[2-3]。總之，OPN是在骨質疏松狀態下RANKL誘導的破骨細胞生成的關鍵調節因子。最近來自多個國家的證據表明，高血清OPN水平與絕經后婦女的低BMD和骨轉換水平相關。根據動物實驗和臨床研究結果顯示，我們推測OPN可能是中國南方絕經后婦女骨量變化的關鍵因素。因此，我們旨在研究血清OPN水平與絕經后婦女RANKL水平、骨密度、骨代謝指標水平的關系，這可能豐富現有的臨床證據。

1 材料和方法

1.1 一般臨床資料

選取2015年7月至2017年8月，在福建醫科大學附屬協和醫院就診的絕經后女性，記錄年齡，身高，體重，絕經年齡，體重指數(BMI)和跌倒病史。排除患有可能影響骨代謝的任何疾病的參與者，包括糖尿病，甲狀腺疾病，甲狀旁腺功能亢進癥，肝腎疾病，癌癥，類風濕性關節炎或其他代謝疾病。此外，也排除了3個月內服用過可能影響骨代謝藥物的受試者(如雙膦酸鹽，利尿劑，腎上腺和甲狀腺藥物，皮質類固醇，維生素D和/或鈣補充劑)。

1.2 血標檢測

早晨從肘靜脈采集空腹血液樣品以確定血清25-羥基維生素D(25(OH)D)，甲狀旁腺激素(PTH)，Ⅰ型前膠原氨基末端前肽(PINP)和Ⅰ型膠原羧基末端交聯端肽(CTX)的水平。將血液樣品(5 mL)收集在真空采血管中，在室溫下以1 000 g離心10 min，將血清分成0.5 mL的等分試樣并儲存在-80 ℃直到用于分析。通過電化學發光免疫分析(ECLIA) (Cobase 411，Roche Diagnostics，Mannheim，德國)測量血清25(OH)D，PTH，PINP和CTX的水平。使用相同的試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)分析所有樣品。血清OPN，RANKL和骨鈣素水平通過酶聯免疫吸附測定(ELISA) (Cusabio Biotech，武漢，中國)測定。 OPN，RANKL和骨鈣素試劑盒的檢測限分別為0.78-50 mg/L，7.8-500 pg/mL和0.312-20 mg/L，所有這些檢測的變異系數為5.0%和5.8。

1.3 骨密度檢查

使用DXA(Lunar Prodigy，GE Medical Systems，Madison，WI，USA)測定腰椎(L1-4)和左股骨頸的BMD。按骨密度檢測結果，根據世界衛生組織標準，骨質疏松癥被定義為T評分為-2.5或更低，骨質減少為T評分在-2.5和-1.0之間，正常為T評分為-1.0或更高；我們將所有女性分為正常組，骨量減少組和骨質疏松組，代表骨質流失嚴重程度。

1.4 統計學分析

正態分布數據以均數±標準差(SD)表示。不滿足正態分布的數據表示為中位數和四分位數間距。使用SPSS版本22.0進行數據分析。數據的正態分布通過Shapiro-Wilk檢驗確定。組間差異用ANOVA和Tukey事后檢驗進行比較。采用受試者工作特征(ROC)曲線分析探討OPN與骨質流失嚴重程度之間的關系。然后確定血清OPN在分類骨質疏松癥或骨質減少時的截止值。用Pearson相關系數進行雙變量相關分析以確定血清OPN水平與各種參數之間的關系。部分相關分析用于調整年齡和BMI。多元回歸分析用于確定自變量對血清OPN水平的影響。P值<0.05被認為有統計學差異。

2 結果

在287名受試者中，平均年齡和BMI分別為63.12±9.78(年)和23.34±456(kg/m2)。 三組患者血清OPN，RANKL，骨鈣素，25(OH)D，PTH，PINP，CTX濃度的中位數(四分位間距)，腰椎和股骨頸的BMD值比較差異有統計學意義(P<0.05)，如表1所示。共有62名受試者(21.6%)在過去12個月中至少有一次跌倒。根據世界衛生組織(WHO)標準，102名受試者(35.5%)被診斷為骨質疏松癥，125名(43.6%)骨質減少，60名(20.9%)正常骨密度。表1總結了研究組的人體測量學，實驗室數據和BMD。骨質疏松組的年齡高于骨量減少組和正常組(均P<0.05)。骨質疏松組的BMI低于骨質減少組和正常組(均P<0.05)。骨質疏松組患者血清RANKL，骨鈣素，PINP和CTX水平較高，25(OH)D和PTH水平低于骨量減少組和正常組(均P<0.05)。骨質疏松組的OPN水平顯著高于骨量減少組和正常組(圖1)。

表1 研究對象的臨床特征Table 1 Clinical characteristics of the studied subjects

注：*P<0.05與正常組比較；#P<0.05與骨質減少組比較。

Note:*P<0.05, compared with normal group;#P<0.05, compared with osteopenia group.

圖1 3組絕經后婦女血清骨橋蛋白水平注：* P<0.05與正常組比較；#P<0.05與骨質減少組比較Fig.1 Serum osteopontin levels in three groupsNote: *P<0.05, compared with normal group; #P<0.05, compared with osteopenia group

我們評估了血清OPN水平與患者和正常婦女的骨相關變量之間的關系。如表2所示，血清OPN水平與骨質疏松組中BMI，腰椎BMD，腰椎BMD T評分，股骨頸BMD，股骨頸BMD T評分，血清PTH、RANKL，PINP，和CTX水平呈負相關。然而，年齡和BMI調整的OPN水平與除CTX以外的上述變量之間均存在相關性。年齡和BMI調整的OPN水平和血清25(OH)D和骨鈣素水平在同一組中沒有發現相關性。

血清OPN水平與血清PTH水平呈負相關，與正常組血清骨鈣素和PINP水平呈正相關。調整年齡和BMI后血清OPN水平與血清PTH，骨鈣素和PINP水平之間存在相關性。未調整的和年齡和BMI調整后的OPN水平與骨量減少組的PTH水平呈負相關。年齡和BMI調整的OPN與其余變量在同一組中沒有發現關聯。使用截斷值計算OPN測試的ROC曲線，靈敏度，特異性和曲線下面積(AUC)。 OPN水平的ROC分析顯示選擇10.2 mg/L的臨界值診斷骨質疏松癥，其產生的AUC等于0.949(SE，0.012；Sig，0.000；95%CI，0.918-0.985)，靈敏度為94.0%，特異性為87.6%。 OPN水平的ROC分析顯示選擇7.2 mg / L的臨界值用于診斷骨量減少，其產生的AUC等于0.758(SE，0.034；Sig，0.000； 95%CI，0.689-0.843)，90.1%的靈敏度和56.8%的特異性。

在對混雜變量進行調整后，進行多元回歸分析以確定OPN的預測因子。如表3所示，當年齡，BMI，腰椎BMD，腰椎BMD T評分，股骨頸BMD，股骨頸BMD T評分和血清RANKL，OPN，25(OH)D，PTH，PINP和包括CTX水平作為獨立變量，BMI，腰椎BMD，RANKL和PTH是骨質疏松組中血清OPN水平的決定因素。只有BMI是OPN在骨質減少組中的預測指標，而骨鈣素，PTH和PINP是正常組OPN的顯著預測指標。

表23組血清OPN水平與其他參數之間的未調整Pearson相關系數(Pearson偏相關系數校正年齡和BMI)

Table2Unadjusted Pearson correlation coefficients (Pearson partial correlation coefficients adjustment for age and BMI) between serum OPN levels and other parameters in three groups

變量正常組未調整(調整)骨量較少組未調整(調整)骨質疏松組未調整(調整)R PRPRP年齡0.05 0.62 -0.08 0.24 -0.05 0.48BMI 0.21 0.04 0.15 0.04 -0.42 0.00L(1-4)BMD-0.07 (-0.20)0.49 (0.07)-0.04 (-0.04)0.51 (0.50) -0.65 (-0.60)0.00 (0.00)L(1-4)BMD T評分 -0.06 (-0.06) 0.53 (0.55) -0.03 (-0.05) 0.63 (0.46) -0.53 (-0.45) 0.00 (0.00)股骨頸BMD-0.18 (-0.20) 0.11 (0.06) -0.08 (-0.08) 0.23(0.24) -0.24 (-0.22) 0.00 (0.01)股骨頸BMD T評分-0.14 (-0.16) 0.11 (0.10) -0.06 (-0.10 0.33 (0.18) -0.40 (-0.37) 0.00 (0.00) RANKL 0.19 (0.57) 0.06 (0.69) 0.08 (0.07) 0.27 (0.31) 0.17 (0.16) 0.02 (0.03)Osteocalcin 0.41 (-0.45) 0.00 (0.00) 0.05(0.02) 0.33 (0.65) 0.17 (0.14) 0.9 (0.13)25(OH)D 0.13 (0.05) 0.12 (0.56) -0.04 (-0.02) 0.52 (0.71) 0.04 (0.07) 0.64 (0.42)PTH -0.22 (-0.21) 0.04 (0.02) -0.22 (-0.16) 0.02 (0.03) -0.24 (-0.20) 0.00 (0.01)PINP 0.36(0.33) 0.00 (0.00) 0.12 (0.10) 0.14(0.18) 0.20 (0.22) 0.01 (0.02)CTX 0.18 (0.10) 0.04 (0.06) 0.05 (0.03) 0.32 (0.21) 0.16 (0.05) 0.03(0.23)

表3 變量的多元回歸分析；骨橋蛋白(OPN)作為因變量Table 3 Multiple regression analysis of the variables, with OPN as the dependent variable

3 討論

在這項研究中，我們的數據顯示，骨質疏松癥絕經后婦女OPN血清蛋白水平濃度高于骨量減少組和正常組婦女。血清高OPN水平與腰椎和股骨頸低BMD呈負相關，與血清RANKL和PINP水平升高呈正相關，提示OPN在絕經后骨質疏松癥中發揮病理作用，可能在骨轉換中起關鍵作用。此外，我們還發現OPN水平高的受試者跌倒發生率顯增高。此外，用于診斷腰椎骨質疏松癥和骨質減少的血清OPN的臨界值分別為10.2 mg/L和7.2 mg/L。表明血清OPN水平超過7.2 mg/L的絕經后婦女應定期檢測BMD，以檢查是否發生骨質疏松或骨質減少。然而，這些統計數據很難與之前的報道進行比較，因為血清OPN濃度取決于檢測方法[9-10]。因此，應該強調的是，即使使用相同的檢測系統測量的血清或血漿OPN水平也只能用于彼此參考。

被稱為絕經后骨質疏松癥的重要預測因子的年齡和BMI[10-11]在我們的研究對象中與OPN水平相關。這項研究符合Chang[10]和Fodor[11]的研究，但另一項研究發現血清OPN水平與年齡或BMI無關[12]。然而，一個有趣的觀察結果是，在骨質疏松癥亞組中發現血清OPN水平和BMI之間唯一的負相關。在正常組和骨質減少亞組中血清OPN水平和BMI之間出現邊緣關聯。在正常組，骨質疏松癥和骨質疏松癥亞組中，未觀察到血清OPN水平與年齡之間的關聯。盡管如此，我們仍然需要排除年齡和BMI相關混雜因素影響循環OPN濃度的可能性。許多研究提供了OPN與骨代謝之間關系的線索。然而，關于OPN水平與BMD之間的關聯存在爭議。一些研究報道絕經后婦女血清OPN水平與BMD呈負相關[10-11]。另一項研究發現沒有骨質疏松癥的肥胖患者沒有關聯[13]。我們的數據顯示骨質疏松亞組血清OPN水平與股骨頸BMD呈負相關。然而，在多元回歸分析中，股骨頸BMD并不是血清OPN水平的獨立預測因子。

我們的研究還發現，在控制年齡和BMI后，OPN與腰椎BMD之間存在顯著負相關。多元回歸分析證實，腰椎BMD是血清OPN水平的決定因素。血清OPN水平與正常和骨質減少亞組的BMD之間沒有顯著相關性。這可能部分解釋了為什么血清OPN水平在絕經后骨質疏松癥女性中更高。在我們的研究中，觀察了血清OPN水平和骨代謝標志物之間的關聯。維生素D狀態被認為是骨骼健康的重要決定因素。血清25(OH)D水平是血液中維生素D狀態的最佳臨床指標。目前，國內常用循環水平低于75 nmol/L的25(OH)D作為不足[14]。我們發現中國絕經后婦女維生素D不足(血清25(OH)D水平575 nmol/L)的患病率很高。研究對象中約61.6%的患者血清25(OH)D水平低于75 nmol/L，與法國絕經后婦女(73.0%)，摩洛哥健康絕經后婦女(85.3%)和印度絕經后婦女(88.2%)[15-17]。最佳維生素D水平抑制甲狀旁腺激素(PTH)的分泌，這是預防繼發性甲狀旁腺功能亢進和骨丟失所必需的，同時血清25(OH)D可以通過增加堿性磷酸酶，骨鈣素和OPN的表達來誘導原代人成骨細胞的成骨分化[18]。雖然我們的數據未能顯示OPN與25(OH)D在所有受試者和三個亞組之間的相關性，但有趣的觀察結果是我們發現在所有受試者和三個亞組中血清OPN水平與PTH呈負相關。血清OPN水平與PTH之間的相關性持續調整年齡和BMI。該模式在多元回歸模型中沒有變化。這似乎是合理的，因為血漿OPN水平被認為是早期間歇性甲狀旁腺激素治療反應的生物標志物[18]。

血清骨鈣素水平反映成骨細胞活性和骨形成速度，OPN是骨重塑的負調節器，PINP是骨形成的標志。在控制年齡和BMI后，我們發現正常組血清OPN水平與骨鈣素和PINP呈正相關。該模式在多元回歸模型中是顯著的。此外，在骨質疏松組中觀察到血清OPN水平與RANKL，PINP和CTX之間呈正相關。偏相關和多元回歸分析證實血清RANKL是OPN水平的預測指標。多元回歸分析證實血清PINP不是OPN水平的決定因素。雖然CTX是骨吸收的標志物，但年齡和BMI調整后的血清OPN和CTX水平之間的相關性并沒有持續存在于骨質疏松組中。OPN是破骨細胞形成的關鍵激活劑，并且在去卵巢大鼠中RANKL介導的破骨細胞生成中起主導作用[18]。我們的研究結果表明，血清OPN水平與血清RANKL水平相關，并且使用血清OPN水平作為調查對象中骨轉換水平的指標是適當的。

這項研究有一些局限性。 這是一個橫截面設計。因此，血清OPN與其他變量之間的關系沒有充分的因果關系。此外，受試者較少，需要進一步的大規模臨床縱向研究以及長期隨訪，以闡明OPN在絕經后婦女骨代謝中的作用。總之，血清OPN水平與絕經后婦女骨密度呈負相關，與骨轉換水平呈正相關。