電針對APP/PS1小鼠學習記憶及β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1表達的影響

黃盛，李瓏，王志福，楊敏光，李建鴻，張嘉泳，陳立典

1.福建中醫藥大學康復醫學院，福建福州市350122；2.福建省康復技術重點實驗室，福建福州市350122；3.福建康復產業研究院技術創新平臺，福建福州市350122；4.國家中醫藥管理局中醫康復研究中心，福建福州市350122

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種年齡相關，以學習記憶等認知功能進行性下降為特點的中樞神經系統退行性疾病[1]；病理學特征為老年斑形成、神經纖維纏結、神經元及突觸丟失。其中β 淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)的異常積累可以觸發神經纖維纏結形成和老年斑塊沉積和神經元退行性變，從而導致學習記憶等認知功能障礙。β 位淀粉樣前體蛋白裂解酶1 (β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1, BACE1)是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)裂解為Aβ 的限速酶和關鍵酶[2-3]。針刺人體特定穴位，可以產生明顯的神經保護作用，對AD 等多種神經退行性疾病均可有效的延緩學習記憶等認知功能損傷[4-5]。

我們前期實驗證實[6-7]，電針百會可改善APP/PS1小鼠大腦葡萄糖代謝，增強腦區神經元增殖、分化和突觸聯系，從而緩解學習記憶等認知功能障礙，本研究觀察電針百會、神庭對APP/PS1 小鼠大腦BACE1表達及Aβ沉積的影響，進一步探討電針改善AD學習記憶能力的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雄性APP/PS1雙轉基因型小鼠24只，體質量(35±2) g，相同背景、月齡野生型小鼠8 只，均購自南京大學模式動物研究所，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室，許可證號SYXK(閩)2014-001。APP/PS1 小鼠編號1～24，以隨機數字表任一數字為起始編號，以抽取的數字除以3，所得余數為0、1、2，相應分到模型組、電針組、非穴組，各8 只；8 只野生型小鼠為野生組。實驗過程中，飼養、干預、犧牲等均嚴格遵守動物福利與倫理準則和指南的相關規定。

1.2 主要試劑和儀器

Aβ 和BACE1 抗體：美國ABCAM 公司。DAB 免疫組化試劑盒：福州邁新生物技術開發有限公司。華佗牌SDZ-Ⅴ電針治療儀、0.5 寸銅柄毫針。RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒：美國Ⅴazym 公司。BACE1及GADPH 引物：上海生工生物有限公司。Morris 水迷宮：中國醫學科學院藥物研究所。

1.3 方法

電針組以30 號毫針斜行刺入百會、神庭[8]，深約0.5 mm，針柄連接電針儀，百會接正極，神庭接負極。取電壓2 Ⅴ，疏密波，頻率1 Hz 和20 Hz。每次30 min，每天1次，共28 d。

非穴組取雙側脅下非經非穴點，左側接正極，右側接負極，參數與電針組相同。野生組和模型組予同等時間和程度的抓取、固定，不予特殊處理。

1.4 Morris水迷宮

水迷宮水池呈圓筒狀，池壁上4 個等距離點分水池為4 個象限，平臺直徑6 cm，放置于第三象限，沒于水面下2 cm，水溫(22±2)℃。攝像系統懸于水迷宮圓心正上方。

1.4.1 定位航行實驗

將小鼠按順時針方向順序從4 個象限面向池壁放入水中。如果小鼠在90 s 內找到平臺并停留3 s 以上，記此為逃避潛伏期。如果小鼠90 s 內未能找到平臺，將其引導到平臺，熟悉15 s，逃避潛伏期記為90 s。共4 d。

1.4.2 空間探索實驗

定位航行實驗后第2 天撤去平臺，小鼠從第一象限放入水中，以原平臺所處位置為優先記錄區域。記錄90 s內小鼠穿過該區域的次數。

1.5 取材

干預及行為學測試結束后，每組取5只小鼠，4%異氟烷1 L/min 吸入麻醉，2 min 后夾捏小鼠皮膚，確認成功麻醉。左心室灌注生理鹽水約50 ml，4%多聚甲醛繼續灌注。迅速斷頭處死，剝離腦組織，4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋，石蠟切片機冠狀切片，厚5 μm。

各組其余3 只同法麻醉，快速取腦，生理鹽水洗凈，-80 ℃凍存。

1.6 Aβ測定

石蠟切片常規脫蠟，枸櫞酸緩沖液熱修復抗原10 min，冷卻至室溫；PBS 漂洗3 次，每次5 min；山羊血清封閉液封閉40 min，加Aβ 一抗(1∶1000) 4 ℃過夜；PBS漂洗；加抗鼠488二抗(1∶1000)37 ℃孵育1 h，PBS 漂洗；DAPI 封片劑封片。以PBS 代替一抗作為陰性對照。以大腦皮質為圖像分析區域，每組取6 個視野，用Nikon 顯微鏡和Image J 圖像分析系統進行圖像采集和處理，測有效陽性面積。

1.7 BACE1測定

石蠟切片常規脫蠟，枸櫞酸緩沖液熱修復抗原10 min，冷卻至室溫；PBS 漂洗3 次，每次5 min；3% H2O2室溫孵育10 min，PBS 漂洗；10%羊血清37 ℃孵育10 min；加BACE1 一抗(1∶300) 4 ℃過夜；PBS 漂洗；加生物素化二抗37 ℃孵育10 min，PBS 漂洗；DAB 顯色，清水漂洗，蘇木素染色30 s。脫水，封片。以PBS 代替一抗作為陰性對照。以大腦皮質為圖像分析區域，每組取6 個視野，用Nikon 顯微鏡和Image J圖像分析系統進行圖像采集和處理，計數陽性細胞數。

1.8 BACE1 mRNA測定

取小鼠凍存腦組織200 mg，加裂解液1 ml充分研磨震蕩；加氯仿200 μl，震蕩混勻，4 ℃靜置10 min；4 ℃、12,000 g 離心15 min；取無色上層溶液500 μl，加預冷異丙醇溶液500 μl，混勻，4 ℃靜置20 min；4 ℃、12,000 g離心15 min，棄上清，白色沉淀加75%乙醇，輕輕吹打，反復洗滌管壁，懸浮沉淀，靜置5 min；4 ℃、12,000 g 離心5 min，棄上清，干燥沉淀，加入DEPC 水20 μl充分溶解，核酸紫外分光光度計測定OD值。取RNA 1 μl加反應體系20 μl，合成cDNA。取cDNA 稀釋后的標準品2 μl，加反應體系20 μl 擴增：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，變性、退火、延伸共30 個循環，最后70 ℃延伸5 min。

BACE1 引物序列：上游5'-CCG GCG GGA GTG GTA TTA TGA AGT-3'；下游5'-GAT GGT GAT GCG GAA GGA CTG ATT-3'。

GAPDH 引物序列：上游5'-TGG AAA GCT GTG GCG TGA T-3'；下游5'-TGC TTC ACC ACC TTC TTG AT-3'。

應用ABI Fast-7500 Real time PCR 儀測目的基因Ct值，計算ΔΔCt。

1.9 統計學分析

采用SPSS 21.0 統計軟件進行統計學處理。數據均以(xˉ±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時，組間兩兩比較采用LSD 檢驗，方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 Morris水迷宮

模型組較野生組逃避潛伏期時間顯著延長(P ＜0.001)。與模型組小鼠相比，電針組逃避潛伏期顯著縮短(P ＜0.001)，非穴組與模型組間無顯著性差異(P ＞0.05)。見表1。

水迷宮軌跡圖顯示，野生組可以迅速判斷平臺所在位置，并迅速找到平臺，軌跡清晰，目標明確；電針組與野生組軌跡圖相近；模型組和非穴組軌跡紊亂，較難找到平臺所在位置。見圖1。

空間探索實驗結果顯示，模型組穿越平臺次數較野生組顯著減少(P ＜0.001)。與模型組相比，電針組穿越平臺次數顯著增多(P ＜0.001)。見表1。

2.2 Aβ測定

野生組未見明顯Aβ 沉積。與模型組和非穴組相比，電針組Aβ 水平顯著減少(P ＜0.001)。見圖2、表2。

2.3 BACE1水平

模型組BACE1 水平顯著高于野生組(P ＜0.001)。與模型組和非穴組相比，電針組BACE1 水平顯著降低(P ＜0.001)。見圖3、表3。電針組BACE1 mRNA水平也顯著降低(P ＜0.001)。見表4。

表1 各組Morris水迷宮結果比較

圖1 各組小鼠水迷宮定位航行軌跡圖

圖2 各組大腦皮質Aβ沉積(免疫熒光染色，200×)

表2 各組Aβ陽性面積比較(IOD)

表3 各組BACE1陽性細胞數比較

3 討論

Aβ 的沉積啟動病理級聯反應；Aβ 蛋白寡聚化后形成淀粉樣沉淀，導致突觸功能障礙，神經元丟失，引起認知功能障礙[9-10]。減少或清除Aβ 可能是預防和治療AD 的重要策略。AD 屬于中醫“呆病”，病位在腦。腦為元神之府，司視聽、思維、記憶等認知相關功能；陽氣充盈上行并填充髓海，是保持認知功能的重要基礎。督脈循行于背部正中，與六陽經均有交匯；督脈通暢保證陽氣充盈入腦，濡養髓海，可以保持或提升認知水平。百會為督脈要穴，為各經脈氣會聚之處，有升陽舉陷，益氣固脫功效；神庭為督脈、足太陽和足陽明經之會，有寧神、開竅等功效。聯合針刺百會、神庭兩穴有益氣升陽、填髓充腦、醒腦開竅之功效，達到改善認知功能的作用[11]。實驗研究也發現[12-13]，電針或針刺可以改善AD小鼠的認知障礙。

APP/PS1 雙轉基因小鼠可以模擬AD 的病理過程，且表現出時間依賴性Aβ 沉積增多等病理特征，以及學習記憶能力緩慢下降等特點，是一種廣泛應用于AD 基礎研究的動物模型[14]。該動物模型將人21、14號染色體上的APP 及PS1 突變基因轉入小鼠，加速Aβ 在腦內的產生，使APP/PS1 小鼠早期即出現可被檢測的空間學習記憶能力減退。大部分實驗研究表明[15-16]，4～5 月齡APP/PS1 小鼠表現出輕微行為學異常；而隨著年齡增長，空間學習記憶能力下降越趨明顯，6～8月齡海馬區開始出現老年斑和Aβ沉積。因此本研究選取8月齡APP/PS1小鼠作為干預對象。

本研究顯示，9 月齡APP/PS1 小鼠空間學習記憶能力下降，大腦皮質BACE1 表達增多，出現顯著Aβ斑塊沉積；電針百會、神庭可以影響BACE1 的表達，減少Aβ，減輕學習記憶損傷。與先前的研究相似[17-18]。

圖3 各組大腦皮質BACE-1表達(免疫組化染色，400×)

表4 各組BACE1 mRNA表達比較

Aβ是由1型跨膜蛋白APP水解而來，水解過程由BACE1 啟動。BACE1 與Aβ 的產生顯著相關[19]。敲除BACE1的小鼠，Aβ沉積明顯減少甚至無Aβ沉積[20-21]。通過siRNA 靶向BACE1 可減少APP 轉基因小鼠Aβ 產生，延緩神經退行性變，改善行為缺陷[22]。電針大椎、腎俞也可以抑制BACE1 表達，從而改善SAMP8小鼠空間學習記憶能力[23]。傳統中藥治療APPⅤ717小鼠同樣發現降低BACE1表達水平，減少AD 模型小鼠腦內Aβ 沉積[24]。抑制BACE1 的表達還能有效減輕突觸損傷、內體功能障礙和溶酶體-自噬系統損傷[25-26]。

BACE1 對AD 的影響機制復雜。本研究顯示，電針可通過影響BACE1 的表達，減少Aβ 產生。電針是否可以通過影響BACE1 的表達從而對突觸損傷、內體功能障礙等產生影響，還有待進一步研究。