赤丸水煎液的心臟毒性作用研究※

●晁利芹 潘曉麗 王 付

赤丸是《傷寒雜病論》中辨治寒痰的重要用方之一，辨治“寒氣，厥逆”。導師王付教授根據張仲景用方要點并結合自身臨床經驗常用于辨治閉塞性脈管炎、深部靜脈炎以及慢性胃炎等。其方由烏頭、半夏、茯苓、細辛所組成，其中“烏頭與半夏”為用藥禁忌中“十八反”內容之一。為此筆者查閱了相關赤丸的實驗研究和臨床運用情況，發(fā)現其研究僅僅局限于相反藥對及單味藥[1]，故本課題重點開展赤丸方藥配伍的整體性及其相互關聯(lián)性的慢性毒性實驗研究，觀察其水煎液對大鼠心臟的毒理作用，以期為臨床安全用藥提供科學的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康清潔級Wistar大鼠，雌雄各半，共80只，體質量200±10g，購于河南省實驗動物中心，合格證號：SCXK（豫）2005-0001。動物房內的飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22℃±3℃，濕度60%±10%，聲響＜60分貝，無對流風，人工晝夜（12h／12h）。大鼠飼料由河南省實驗動物中心提供。本研究涉及所有實驗均通過河南中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會。

1.2 試劑與儀器75%乙醇：100mL，洛陽德之康生物工程有限公司，批號：090706；95%乙醇：2500mL，衛(wèi)輝市眾誠消毒制劑有限公司，批號：090206；烏拉坦：上海曹揚第二中學化工廠生產，批號：080517；肝素鈉注射液：2mL，12500U，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，產品批號：09 061012；甲醛溶液：天津市博迪化工有限公司，500mL/瓶，批號：20 080823；BL-420生物機能實驗系統(tǒng)檢測心電圖：成都泰盟公司；全自動生化分析儀：型號AT-738，上海安泰分析儀器有限公司；生物顯微鏡：型號OLYMPUS-CX40，日本奧林巴斯公司；輪轉式切片機：型號LEICA2025，德國徠卡儀器有限公司；電子天平：型號AE-240METTLER；賽多利斯精密天平：型號BS210S，北京賽多利斯天平有限公司；電熱恒溫干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；LEICARM2135型石蠟切片機：德國LEICA公司。

1.3 實驗藥物及制備實驗藥物：于鄭州市華龍中藥行購買茯苓、生川烏、遼細辛、法半夏四味中藥材，并由河南中醫(yī)藥大學藥學院鑒定合格。

藥物制備：依據全國高等中醫(yī)藥院?！督饏T要略》赤丸方的用量按重浸漬法[2]提取藥物成份，并濃縮為濃度200%（2g生藥/mL）的溶液。制備方法如下：取茯苓12g、生川烏6g、法半夏12g、遼細辛3g，依比例計算、稱量、粉碎所需受試藥物，將上藥混合用實驗所需的水溶液分三次提取有效成分，將三次浸提液混合過濾，調整至實驗所需容積，加熱沸騰后持續(xù)煎煮60min，濾其藥液；所得藥液的量即為當天各給藥組所需濃度為200%（2g生藥/mL）的溶液。

1.4 實驗方法（1）實驗動物分組：80只Wistar大鼠，雌雄各半分籠，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機每20只雌雄各半大鼠分為1組，共分4組，即赤丸水煎液高劑量組、中劑量組、低劑量組、正常對照組。

（2）實驗分期：實驗全程分為灌胃期和恢復期兩期。灌胃期是大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，持續(xù)灌胃90天的這個時期。恢復期是灌胃結束后，每組隨機選10只大鼠處死檢測，剩余的40只大鼠停止灌胃，繼續(xù)一般飼養(yǎng)3周的這段時間。

（3）給藥方法：各給藥組根據人與大鼠的體表面積比，即大鼠用藥為人用藥量的7倍，依次按33g、16.5g、5.5g生藥/（kg·d）劑量灌胃，對照組用蒸餾水灌胃，灌胃體積為同等體重條件下高劑量組大鼠灌胃時所需藥液的劑量。每日定時（15：00）灌胃1次，6次/周灌胃，每周日檢測大鼠的體重，每周根據稱重情況調整給藥劑量，各組連續(xù)灌胃90天。

（4）實驗樣品收集：末次灌胃后，大鼠禁食不禁水2h，腹主動脈取血于普通的真空采血管中，4℃，3000r/min，離心15min，收集上清液，于-80℃保存?zhèn)溆?。采血完畢后，剖腹迅速取出完整心臟，除凈周圍的結締組織，切取大鼠同一部位的心臟組織，放入裝有4%甲醛溶液的標本瓶里，固定48h后，脫水，置于包埋盒中，做好標記，切片，HE染色，在光學顯微鏡下進行觀察心臟組織病理學變化。

（5）一般中醫(yī)癥候指標觀察：神志、皮毛、呼吸、行動、飲食、二便、分泌物等表現。

（6）心電圖檢測：灌胃前，每組隨機選10只大鼠在乙醚麻醉作用下采用BL-420生物機能實驗系統(tǒng)進行心電圖檢測，并于末次給藥后的次日的上午，進行相同的心電圖檢查。

（7）心功能指標測定：LDH、CK。在灌胃期結束末次大鼠心電圖檢測后，腹腔注射20%的烏拉坦（5mL/kg）進行麻醉，然后，從大鼠的腹主動脈取5mL血液，離心，存放，檢測。

（8）恢復期大鼠的檢測方法：進行與給藥期相同的檢測，借此觀察赤丸方的毒性反應是否具有可逆性，抑或是否出現遲緩性的毒性。

1.5 統(tǒng)計分析方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對實驗所得數據進行整理和分析，計數資料用χ2檢驗，計量資料用t檢驗，各組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 赤丸水煎液對大鼠一般生長情況的影響在實驗過程中，除赤丸水煎液高劑量組大鼠外，其余各組大鼠在飼養(yǎng)期間，狀態(tài)良好，精神佳，活動靈活，皮毛光滑有色澤，食欲正常，未見異常分泌物。赤丸水煎液高劑量組大鼠飼養(yǎng)期間，精神不振，行動遲緩，皮毛不光滑，腹部微脹，食欲差并伴有不同程度的腹瀉。其中有2只大鼠在灌胃的第4、5周出現異常反應，體重增長較正常大鼠的速度慢，于第11、12周時，有5只大鼠出現了中毒反應，第67、83天，有2只大鼠死亡，隨即解剖2只大鼠制作心臟病理切片，觀察心臟組織形態(tài)。余實驗組沒有發(fā)現異常情況。

2.2 赤丸水煎液對大鼠體重的影響灌胃前：不同大鼠實驗組間體重無顯著差異（P＞0.05）；灌胃期：與正常對照組比較，赤丸水煎液低、中劑量組大鼠體重無顯著性差異（P＞0.05），赤丸水煎液高劑量組大鼠的體重明顯增長緩慢（P＜0.05），具有統(tǒng)計學意義。在動物試驗中，體重數值的高低可以作為整個機體變化的一個重要指標，在本課題的赤丸水煎液慢性毒理試驗過程中，每周稱量大鼠體重，既是調整給藥劑量的依據，又是觀察大鼠毒性反應的一個重要試驗指標。本課題結果證實，赤丸水煎液高劑量組大鼠的體重受到了很大的影響，余給藥組大鼠的體重未受到影響?；謴推冢翰煌o藥組大鼠的體重與正常對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。提示：長期大劑量口服赤丸水煎液對大鼠體重的增長具有影響作用，然而，一旦停止給藥一段時間后，就可恢復到正常體重。見表1。

2.3 赤丸水煎液對大鼠心電圖的影響灌胃前：與對照組比較，不同赤丸水煎液劑量組大鼠的心電圖包括心率，均無顯著性差異（P＞0.05）。灌胃期：與對照組比較，赤丸水煎液低、中、高劑量組大鼠的心電圖、心率均無顯著性差異（P＞0.05）?；謴推冢翰煌o藥組大鼠的心電圖、心率與正常對照組相比也無顯著性差異（P＞0.05）。本結果心率平均在335次/min。II、Ⅲ、avF導聯(lián)p波直立高尖，avR導聯(lián)倒置，時限、振幅正常，QRS波V1導聯(lián)主波向下，Ⅱ、Ⅲ、aVF向上，時限及振幅未見異常，J點抬高，T波前支陡后支緩。可以看出，長期灌服低、中、高劑量的赤丸水煎液對大鼠心臟無毒性反應。心電圖見圖1，心率結果見表2。

表1 各組大鼠體重比較（g，）

表1 各組大鼠體重比較（g，）

注：與對照組比較，★P＜0.05

圖1 赤丸方水煎液對大鼠心電圖的影響

2.4 赤丸水煎液對大鼠心肌酶的影響灌胃期：赤丸水煎液不同劑量組大鼠的LDH、CK與正常對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。本結果證實，赤丸水煎液低、中、高劑量組大鼠的心肌細胞均未受到損害?；謴推冢翰煌嗤杷逡簩嶒灲M大鼠的LDH、CK與正常對照組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。本課題結果說明，不論灌胃期，還是恢復期，赤丸水煎液低、中、高劑量組大鼠的心肌細胞均未受到損害。見表3。

表2 各組大鼠心率比較（次，）

表2 各組大鼠心率比較（次，）

2.5 赤丸水煎液對大鼠心臟的組織形態(tài)的影響整體情況：不同實驗組大鼠心臟的結構完整，表面光滑，形態(tài)體積、色澤均正常，未見水腫、充血、糜爛，組織無隆起、脫落，觸及質地也未發(fā)現異常。

形態(tài)組織學觀察：在灌胃期、恢復期，在光鏡下觀察實驗各組大鼠的心臟結構形態(tài)結果具有一致性，均可見到由心外膜、心肌膜、心內膜構成的心臟壁，心肌細胞排列整齊，核居中，無變性、壞死等損傷性改變，間質內未見炎性細胞浸潤、缺血、水腫等病理性改變。

表3 各組大鼠LDH、CK變化比較（U/L，）

表3 各組大鼠LDH、CK變化比較（U/L，）

本課題實驗結果表明，在灌胃期及恢復期，各組大鼠的心臟組織形態(tài)皆未出現異常。見圖2。

圖2 光鏡下赤丸水煎液對大鼠心臟形態(tài)學的影響

3 討論

王付教授在臨床中經常辨證使用赤丸方加味治療各種疑難雜癥[3]，療效卓著。由于赤丸組方之藥性的特殊性，所以進行該方的動物實驗研究是很有必要的?；诒緦嶒炃捌诎l(fā)現赤丸水煎方對機體肝、腎、內分泌系統(tǒng)均無毒性反應[4]，本研究則進一步探討赤丸水煎液有無心臟毒性的影響，借此觀察存否心臟的急毒與慢毒反應，是否具有可逆性。在給藥期，高劑量組大鼠體重增長顯著緩慢，但停藥21d后，大鼠體重恢復到正常水平。不論在給藥期還是恢復期，各組大鼠的心率、心電圖、心肌酶（LDH、CK）及心臟組織病理學均未現病理性改變。

赤丸方中雖然含有有毒中藥，且有十八反的配伍禁忌藥物，但是在研究中發(fā)現低、中、高濃度的赤丸水煎液對大鼠心臟均未產生不良的反應。赤丸方中，茯苓性味甘、淡、平，無毒副作用，且有免疫調節(jié)和保肝護肝的作用。細辛，辛、溫，有小毒?！吨袊幍洹穼⒓毿恋某扇巳沼昧慷椴坏贸^3g[5]。在赤丸方中細辛用量為一兩（3g），屬安全范圍。烏頭辛、甘、大熱，有大毒，其毒性可隨煎煮時間延長而減弱或消失[6]。半夏辛、溫，有小毒。半夏與烏頭屬于十八反，屬配伍禁忌。但從藥理毒理相互作用上看，其毒性很可能被消除或減弱。烏頭的毒性主要為心臟的毒性及神經系統(tǒng)毒性。而現代藥理研究表明半夏具有鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)吐、抗心律失常的作用，能夠很好的拮抗烏頭引起的心臟毒性[7-9]。同時，細辛還具有強心、擴血管、降壓及保護心肌的作用。全方半夏燥濕化飲，茯苓利濕化飲，烏頭、細辛既能通陽散寒又能溫化寒飲，四藥相互為用，以建其功[10]。

綜上所述，赤丸方水煎液對心臟未見毒性反應，為臨床治療寒飲內阻之痼疾提供了動物實驗依據。