平喘固本膏方對(duì)COPD穩(wěn)定期大鼠模型樹突狀細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞的影響※

●彭草云 阮月芳 葉甫澄 張 峰

近年來樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)在慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）的發(fā)病中所起的作用逐漸受到重視，認(rèn)為其在COPD的發(fā)病中充當(dāng)“前哨”的作用，當(dāng)DCs獲取外來抗原后，將其遞呈給T淋巴細(xì)胞主要是CD8+T細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮免疫效應(yīng)，促使COPD的發(fā)病[1]。平喘固本湯系治療肺脹肺腎氣虛證的名方，該方具有補(bǔ)肺納腎、降氣化痰之功。筆者前期的研究表明平喘固本膏方對(duì)改善COPD穩(wěn)定期患者的咳嗽氣喘癥狀有一定療效[2]，并可降低COPD大鼠血清白介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factors，TNF-α）水平[3]。為進(jìn)一步研究平喘固本膏治療COPD的作用機(jī)理，筆者又將其對(duì)COPD穩(wěn)定期大鼠模型樹突狀細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞的影響進(jìn)行了研究，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠60只，雄性，體重200±20g。由嘉興醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 平喘固本膏方：黨參300g，五味子120g，胡桃肉240g，靈磁石360g，蘇子300g，款冬花240g，法半夏240g，橘紅120g。上藥加適量水浸泡24小時(shí)，后煎煮取汁、過濾共3次，將3次煎液混合后濃縮至2 000 mL左右，加入細(xì)研成粉的坎臍粉、沉香粉各300g，最后加入蜂蜜250g煉制收膏，每毫升膏劑約含生藥1.26g。膏方由嘉興市中醫(yī)院制劑室制作。氨茶堿片：天津力生制藥股份有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字H12020118）。脂多糖，購(gòu)自Sigma公司。

1.1.3 主要試劑與儀器 抗大鼠白細(xì)胞分化抗原分化群80（cluster of differentiation 80，CD80）單克隆抗體(ab62636)及抗大鼠CD86單克隆抗體(ab119857)由艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司提供，大鼠IL-10（EKR30159）及大鼠IL-12（EK-R30163）由上海酶研生物科技有限公司提供，CD4抗體（11-0040-81）、CD8抗體（12-0084-82）由Thermo Fisher Scientific提供。全自動(dòng)流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)Becton Dikingson公司，BD FACSVerse），酶標(biāo)儀（DENLEY DRAGON Wellscan MK 3）購(gòu)自芬蘭Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與造模 隨機(jī)分為6組：COPD穩(wěn)定期模型組，高、中、低劑量膏方治療組、氨茶堿組和空白組。除空白組外，均建立COPD穩(wěn)定期模型，按宋一平等[4]的方法建立，即第1、14天氣管內(nèi)注入脂多糖200μg/200μl，第2～28天在容積為84 L的密閉箱內(nèi)熏雄獅牌香煙，0.5 h/每日上午。

1.2.2 給藥方法 造模成功后每日1次灌胃給藥，連續(xù)給藥30天。給藥劑量根據(jù)大鼠體重按成人一日劑量折算[按公式大鼠等效劑量(mg/kg)=折算系數(shù)×成人劑量(mg/kg)]計(jì)算出大鼠等效劑量[5]，以等效劑量為中劑量即1.512g/(200g·d)。高劑量組以6.048g/(200g·d)灌胃，中劑量組以1.512g/(200g·d)灌胃，低劑量組以0.378g/(200g·d)灌胃。氨茶堿組用氨茶堿片以7.2mg/(200g·d)灌胃，模型組灌以生理鹽水。

1.2.3 取材和指標(biāo)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后頸動(dòng)脈取血制備血清，IL-10和IL-12檢測(cè)采用雙抗體夾心ABCELISA法，CD4+T、CD8+T采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 計(jì)算機(jī)圖像分析以胞膜、胞質(zhì)或胞核染成棕黃色或黃色的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。對(duì)比右下肺HE及免疫組化染色圖片，確定大鼠肺實(shí)質(zhì)的DCs數(shù)量。每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，使用IPP6.0軟件計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)以及總細(xì)胞數(shù)，陽性率=陽性細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)×1 000‰，取平均值作為該切片的陽性細(xì)胞率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，計(jì)量資料采用方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)各組數(shù)據(jù)方差齊性檢驗(yàn)P值均大于0.05，采用單因素方差分析，即One-Way ANOVA，以LSD分析方法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清IL-10、IL-12、CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T檢測(cè)結(jié)果顯示，高劑量組在降低IL-2及CD8+T方面優(yōu)于氨茶堿（P＜0.05），而高中低各劑量組及氨茶堿組在降低IL-10、CD4+T及CD4+T/CD8+T方面無明顯差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠IL-10、IL-12、CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T結(jié)果（）

表1 各組大鼠IL-10、IL-12、CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T結(jié)果（）

注：＃各組的總體比較：CD4各組比較F=1.596，P=0.186，CD4/CD8＃各組比較F=1.829，P=0.132，其余指標(biāo)各組比較P值均為0.000；△高劑量組與氨茶堿組比較：IL-12兩組比較P=0.027，CD8兩組比較P=0.0275，余指標(biāo)比較P值均大于0.05

2.2 大鼠DC表面分子標(biāo)記物表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，膏方各組均能降低COPD大鼠DC表面分子標(biāo)記物CD80及CD86的表達(dá)，在降低CD80的表達(dá)上，高劑量組與氨茶堿組比較有顯著差異（P＜0.05），但中劑量組及低劑量組與氨茶堿比較無顯著差異（P＞0.05）；在降低CD86的表達(dá)上，高劑量組及中劑量組與氨茶堿比較均有顯著差異（P＜0.05），而低劑量組與氨茶堿比較無顯著差異（P＞0.05）。見表2。

3 討論

DCs廣泛分布于肺內(nèi)各級(jí)氣道、血管、實(shí)質(zhì)、肺泡腔以及臟層胸膜，它是目前已知的唯一可以激活初始T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞，其對(duì)T細(xì)胞免疫應(yīng)答和免疫耐受均具有調(diào)節(jié)作用[6]。DCs可表達(dá)多種輔助分子，其中CD80和CD86是初始CD4+T淋巴細(xì)胞的激活所需的最重要的共刺激分子，CD80能夠誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，而CD86能夠誘導(dǎo)Th細(xì)胞分化為Th2細(xì)胞［7-8］。活化的樹突狀細(xì)胞通過釋放IL-12和表達(dá)協(xié)同共刺激因子，使局部固有的CD8+T細(xì)胞活化，從而產(chǎn)生誘發(fā)和維持局部免疫炎癥反應(yīng)[9]。

表2 各組大鼠DC表面分子標(biāo)記物表達(dá)陽性率（，‰）

表2 各組大鼠DC表面分子標(biāo)記物表達(dá)陽性率（，‰）

注：＃各組的總體比較：CD80＃與CD86＃總體比較P值均為0.000；△高劑量組與氨茶堿組比較：CD80兩組比較P=0.011，CD86兩組比較P=0.007；＊中劑量組與氨茶堿組比較：CD80兩組比較P=0.159，CD86兩組比較P=0.039；※低劑量組與氨茶堿組比較：CD80兩組比較P=0.134，CD86兩組比較P=0.173

T淋巴細(xì)胞尤其是CD8+T在COPD的發(fā)生過程中扮演著重要的角色。研究證實(shí)，不論在COPD急性加重期還是在穩(wěn)定期，CD4+T和CD8+T均明顯升高。CD4+T細(xì)胞中的Th1通過分泌IL-2和γ干擾素（interferon-γ，INF-γ）等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶-12（matrix metalloproteinase-12，MMP-12）和MMP-9，從而導(dǎo)致彈性蛋白水解和肺氣腫形成，Th17細(xì)胞也可通過分泌IL-17等炎性細(xì)胞因子導(dǎo)致肺氣腫形成[10]。CD8+T通過分泌IFN-γ 和TNF-α 對(duì)感染和改變的宿主細(xì)胞起到溶解的作用，從而在COPD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[11]。本研究顯示，模型組CD4+T和CD8+T均較空白組升高，但CD8+T升高更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高劑量膏方在降低CD8+T方面優(yōu)于氨茶堿，但中劑量膏方和低劑量膏方則與氨茶堿比較無明顯差異。

然而，T細(xì)胞要發(fā)揮作用，需要樹突狀細(xì)胞的輔助。研究證實(shí)，長(zhǎng)期煙霧暴露后，不僅巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞等炎性細(xì)胞增多，肺部DCs數(shù)量及亞群功能也會(huì)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致免疫功能失調(diào)[12]。大多數(shù)研究認(rèn)為，在COPD患者和動(dòng)物模型中DCs的數(shù)量增多[13-14]，并且在COPD患者中DCs表面CD80和CD86的表達(dá)水平明顯升高，而白藜蘆醇等藥物可有效地抑制COPD中CD80和CD86等共刺激分子的激活[15]。

既往的研究表明，平喘固本湯膏方在改善COPD穩(wěn)定期患者的咳嗽氣喘癥狀及降低COPD大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α 水平等方面有一定作用[2-3]。其對(duì)DCs的作用如何尚不清楚，而中藥是否也能通過調(diào)節(jié)DCs從而達(dá)到治療COPD的效果尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果證實(shí)，經(jīng)煙熏及氣管內(nèi)注射脂多糖處理后的大鼠肺組織中CD80和CD86水平顯著升高（P＞0.05）。在降低CD80方面，平喘固本膏方高劑量組優(yōu)于氨茶堿組，但中劑量組及低劑量組與氨茶堿組比較無顯著差異。在降低CD86方面，高劑量組及中劑量組優(yōu)于氨茶堿組，但低劑量組與之比較無顯著差異，顯示平喘固本膏方在調(diào)節(jié)DCs細(xì)胞方面呈劑量依賴性。

IL-10是一種抑制性細(xì)胞因子，能夠抑制IL-1、IL-2、IFN-γ、TNF-α 等多種細(xì)胞因子的合成及活性。IL-10降低及其調(diào)控分泌的促炎癥細(xì)胞因子的增加可能是氣道持續(xù)炎癥并導(dǎo)致氣道重塑、氣流受限、肺組織破壞及肺氣腫等病理過程的重要機(jī)制[16]。IL-12作為巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子，它不僅可獨(dú)立作用于NK細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞毒性炎性反應(yīng)，在COPD的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。本研究表明，模型組IL-10明顯低于其余各組，而模型組IL-12則明顯升高。與氨茶堿組比較，高劑量膏方能更好地降低IL-12，但在升高IL-10方面，膏方各劑量組與氨茶堿比較均無明顯差異。

因此，筆者初步的研究結(jié)果證明，高劑量平喘固本湯膏方在降低IL-12、CD8+T及CD80和CD86等方面有一定作用，推測(cè)平喘固本湯膏方除通過調(diào)節(jié)IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α 等炎癥介質(zhì)起到治療COPD的作用外，還可能與調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞及DCs有關(guān)，值得深入研究。COPD穩(wěn)定期的藥物治療以吸入劑為基礎(chǔ)，但茶堿緩釋片口服仍具有改善肺功能、提高生活質(zhì)量的作用[17]，因此，我國(guó)2013年COPD診治指南將茶堿作為吸入劑的替代方案之一[18]。由于實(shí)驗(yàn)研究的限制，筆者采用了氨茶堿片而非茶堿緩釋片作為對(duì)照藥物，可能對(duì)研究結(jié)果存在一定的影響，今后需進(jìn)一步改進(jìn)研究方案。