miR-29c對TNF-α誘導的人臍靜脈內皮細胞增殖與凋亡的影響及其機制的初步研究

陳武哲　冷超群　何彬彬

[摘要] 目的 研究miR-29c對TNF-α誘導的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）增殖與凋亡的影響及其作用機制。 方法 空白對照組、miR-29c過表達陰性對照組、miR-29c過表達組、miR-29c抑制表達陰性對照組、miR-29c抑制表達組預先轉染HUVECs，再用TNF-α（10 ng/mL）誘導HUVECs 48 h，然后分別采用MTT法和Hoechst 33342熒光染色法檢測miR-29c對TNF-α誘導HUVECs增殖活力及凋亡的影響;再采用Western blot技術檢測miR-29c對Akt、eNOS磷酸化水平及eNOS蛋白表達的影響。 結果 miR-29c可顯著降低TNF-α誘導的HUVECs的增殖活力（P<0.05）;Heochst 33342熒光染色結果顯示，miR-29c可促進TNF-α誘導的HUVECs凋亡（P<0.05）;miR-29c可顯著下調Akt、eNOS的磷酸化（P<0.05），但其對eNOS蛋白的表達無影響。 結論 miR-29c可降低TNF-α誘導的HUVECs增殖，并促進其凋亡，其機制可能與下調Akt、eNOS的磷酸化相關。

[關鍵詞] miR-29c;人臍靜脈內皮細胞;TNF-α;增殖;凋亡

[中圖分類號] R363? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）35-0035-06

Effect of miR-29c on TNF-α induced proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells and its mechanism

CHEN Wuzhe? ?LENG Chaoqun? ?HE Binbin

Department of Basic Medicine， Yongzhou Vocational and Technical College， Yongzhou? ?425000， China

[Abstract] Objective To study the effect of miR-29c on the TNF-α induced proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） and its mechanism. Methods HUVECs were pre-transfected with blank control group， miR-29c mimics negative control group， miR-29c mimics group， anti-miR-29c negative control group and anti-miR-29c group， and then HUVECs were induced with TNF-α （10 ng/mL） for 48 hours， after which MTT assay and Hoechst 33342 fluorescence staining were used to detect the effect of miR-29c on the TNF-α induced proliferation and apoptosis of HUVECs. Then Western blot was used to detect the effect of miR-29c on Akt and eNOS phosphorylation and eNOS protein expression. Results The TNF-α induced proliferation of HUVECs was significantly decreased by MiR-29c （P<0.05）. It was found by Heochst 33342 fluorescence staining that the TNF-α induced apoptosis of HUVECs was promoted by miR-29c （P<0.05）; The phosphorylation of Akt and eNOS was significantly down-regulated by miR-29c （P<0.05）， but the expression of eNOS protein was not affected by miR-29c. Conclusion MiR-29c can reduce the TNF-α induced proliferation of HUVECs and promote their apoptosis. The mechanism may be related to the down-regulation of Akt and eNOS phosphorylation.

[Key words] MiR-29c; Human umbilical vein endothelial cells; TNF-α; Proliferation; Apoptosis

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種慢性進行性疾病，血管內皮細胞損傷在動脈粥樣硬化發生、發展中具有重要作用，是動脈粥樣硬化形成的始動因素[1-2]。近年來的報道顯示，miRNAs與AS的形成密切相關，在病理性心臟和血管組織中miRNA-21表達出現異常，提示miRNA-21與高血壓、心肌梗死、心臟瓣膜病的形成有關[3]，miRNA-1-2功能失調導致AS及心血管疾病的發生發展[4]。同時，有研究顯示microRNA對心血管細胞的生長、分化、增殖及凋亡有重要的調控作用[5-6]。Schlabritz-Loutsevitch N等[7]研究發現miRNA-29與妊娠肥胖有關;而Li LY等[8]報道miRNA-29c可促進惡性膠質瘤的增殖、遷移、分化;Hu Y等[9]研究發現miRNA-29c通過靶向結合IGF-1的3′-UTR，參與調節HUVECs的細胞循環、增殖和血管形成等。miR-29c調控通路廣泛，作用復雜，但有關miR-29c調控TNF-α誘導的人臍靜脈內皮細胞增殖與凋亡的作用鮮少報道。本研究主要探討miR-29c在TNF-α誘導的人臍靜脈內皮細胞中對其細胞增殖與凋亡的影響及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

HUVECs購于北京大學醫學院腫瘤研究所。miR-29c mimics、miR-29c mimics陰性對照、miR-29c inhibitor陰性對照、miR-29c inhibitor來源于上海吉瑪公司;轉染試劑和無血清培養基來源于Invitrogen公司;MTT試劑來源于AMRESCO公司;TNF-α來源于Sigma公司;BCA試劑盒、ECL試劑盒和Heochest 33342染色液均來源于碧云天研究所;總一氧化氮檢測試劑盒來源于碧云天公司;p-Akt、eNOS、p-eNOS抗體來源于Cell Signaling公司;β-actin來源于Bioworld公司、二抗來源于康為世紀公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理? 取HUVECs培養于適宜溫濕度條件下，選擇生長至80%融合的細胞進行各指標檢測。采用接種于96孔板的細胞組，使用MTT法篩選miR-29c mimics轉染HUVECs的最佳濃度和時間，并使用同法檢測miR-29c對HUVECs增殖活力的影響;采用接種于6孔板的細胞組，使用Hoechst 33342染色法檢測miR-29c對HUVECs凋亡的影響，使用Western blot技術檢測miR-29c對Akt、eNOS磷酸化水平、eNOS蛋白表達的影響。

1.2.2 細胞的轉染? 取HUVECs接種于培養板中進行常規培養，至細胞融合度為80%～90%進行試驗，每組設置3個復孔。轉染前，先將miR-29c mimics、miR-29c陰性對照組、miR-29c inhibitor陰性對照、miR-29c inhibitor分別與適度濃度的培養基輕輕混勻，室溫孵育5 min;然后將適宜濃度的Opti-MEMI培養基與轉染試劑（LipofectamineTM2000）混勻，在室溫條件下孵育5 min;混勻上述兩步的混合試劑，在室溫條件下孵育20 min后，將其加入含有HUVECs及Opti-MEMI培養基的培養板中，輕輕混勻。

1.2.3 MTT法檢測HUVECs增殖活力? 將HUVECs以適宜的密度接種于96孔板中，并設置3個復孔，待培養板中的HUVECs融合率達到30%～40%時，加入DMEM培養基（不含血清），再按要求處理細胞（待同步培養12 h后），每組各孔細胞均加入DMEM培養基（含血清，200 μL）和MTT溶液（20 μL），培養4 h后棄去上清，每個培養孔中加入DMSO（150 μL）后輕輕搖動5 min，將培養孔細胞放置于酶標儀（490 nm波長）處測吸光度值（OD）。HUVECs增殖活力（%）=實驗組/對照組×100%。

1.2.4 Hoechst 33342熒光染色法檢測HUVECs凋亡? 將HUVECs接種于6孔板中，待細胞生長至培養孔面積的80%時，加入培養基并培養12 h，細胞按要求處理后再吸干培養板中的原培養液，每個培養孔中加入多聚甲醛（4%、1 mL），在4℃條件下固定20 min后潤洗3次，最后每個培養孔中加入1 mL的Heochst 33342染色液，在37℃的條件下染色20 min后潤洗3次，于倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 Western blot法檢測HUVECs的eNOS、p-Akt及p-eNOS磷酸化蛋白的表達? 采用BCA蛋白定量法進行HUVECs總蛋白的蛋白定量檢測。每組取50 μg蛋白與等量4×SDS加樣緩沖液混勻，置100℃加熱，蛋白變性5 min，點樣并進行SDS-PAGE電泳，然后切膠，PVDF膜用含5%脫脂奶粉的PBS封閉2 h，加p-AKT（ser473）、eNOS、p-eNOS（Ser1177）抗體于PBST室溫孵育2 h，洗膜，PBST室溫孵育4 h后孵育二抗3 h，洗膜，然后用ECL試劑盒顯色，最后用凝膠圖像處理系統分析目的條帶。

1.2.6 總一氧化氮檢測試劑盒檢測HUVECs中NO釋放量? 使用TNF-α誘導人臍靜脈內皮細胞48 h后，取100 μL的HUVECs培養液，采用總NO檢測試劑盒檢測培養液中NO的濃度及釋放量。

1.3 統計學方法

采用SPSS13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異有高度統計學意義。

2 結果

2.1 TNF-α誘導HUVECs最佳時間和濃度的篩選

采用MTT法檢測TNF-α在不同作用時間和濃度條件下對HUVECs增殖的影響，評估TNF-α對HUVECs的最佳誘導時間和濃度。采用不同濃度的TNF-α（0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、30 ng/mL、50 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL）誘導HUVECs 48 h，結果顯示HUVECs的增殖活力隨TNF-α誘導濃度的增加而降低，當TNF-α的誘導濃度達到10 ng/mL時，HUVECs增殖活力較空白對照組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），因此，選取10 ng/mL為TNF-α最佳誘導濃度，見表1。TNF-α（10 ng/mL）以不同時間（0 h、12 h、24 h、36 h、48 h）作用于HUVECs后，隨著作用時間的延長，細胞增殖活力呈時間依賴性下降，當作用時間為48 h時，相較于空白對照組（0 h處理組）明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），因此，選取TNF-α最佳誘導時間為48 h，見表2。

2.2 TNF-α誘導對HUVECs miR-29c表達的影響

采用qRT-PCR法檢測TNF-α在不同濃度和作用時間條件下對HUVECs中miR-29c表達的影響，評估在HUVECs中TNF-α誘導與miR-29c表達的關聯性。以不同濃度的TNF-α（0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、30 ng/mL、50 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL）誘導HUVECs 48 h，結果顯示miR-29c的表達量隨TNF-α濃度的增大，呈濃度依賴性增加，與空白對照組（0 ng/mL組）比較，雖然低濃度處理組（5 ng/mL）差異不明顯（P>0.05），但當TNF-α濃度達到10 ng/mL時，miR-29c表達量差異顯著增加，差異具有統計學意義（P<0.05），見表3。10 ng/mL的TNF-α不同作用時間（12 h、24 h、36 h、48 h）誘導組與空白對照組（0 h處理組）相比較，miR-29c表達量明顯增加，當作用時間為48 h時，差異明顯（P<0.05），且隨著作用時間的延長，miR-29c表達量呈時間依賴性增加，見表4。故在HUVECs中，TNF-α誘導miR-29c的表達量呈時間及劑量依賴性增加。

2.3 miR-29c mimics轉染對HUVECs增殖活力的影響

采用MTT法檢測不同轉染濃度和作用時間的miR-29c mimics對細胞增殖活力的影響，評估miR-29c mimics轉染HUVECs的效果。使用不同濃度的miR-29c mimics（0 nmol/L、5 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、80 nmol/L、100 nmol/L）轉染HUVECs 48 h，檢測細胞增殖活力。結果顯示，相對于空白對照組（0 nmol/L），濃度為50 nmol/L的轉染組，其細胞增殖活力明顯降低（P<0.05），miR-29c mimics轉染效果更好，見表5。再將miR-29c mimics（50 nmol/L）分別作用于HUVECs 12 h、24 h、36 h、48 h，結果顯示，與空白對照組（0 h處理組）相比，細胞增殖活力隨作用時間延長而下降（P<0.05），表明miR-29c mimics隨作用時間延長轉染效果越好，見表6。

2.4 miR-29c對經TNF-α誘導的HUVECs增殖的影響

空白對照組、miR-29c過表達陰性對照組（miR-29c scramble control）、miR-29c過表達組（miR-29c mimics）、miR-29c抑制表達陰性對照組（miR-29c anti- scramble）、miR-29c抑制表達組（miR-29c inhibitor，anti-miR-29c）預先轉染HUVECs，再用TNF-α（10 ng/mL）誘導HUVECs 48 h。與空白對照組相比，miR-29c mimics陰性對照組和miR-29c inhibitor陰性對照組細胞增殖活力的差異不明顯（P>0.05）;與空白對照組、陰性對照組相比，miR-29c 過表達組細胞增殖活力明顯下降（P<0.05），miR-29c抑制表達組細胞增殖活力明顯增加（P<0.05）。表明在TNF-α誘導的HUVECs中，miR-29c可明顯抑制其增殖，見表7。

2.5 miR-29c對經TNF-α誘導的HUVECs凋亡的影響

空白對照組、miR-29c過表達陰性對照組、miR-29c過表達組、miR-29c抑制表達陰性對照組、miR-29c抑制表達組分別轉染HUVECs，再用10 ng/mL的TNF-α誘導HUVECs 48 h，Heochst 33342染色結果顯示空白對照組（封三圖1A）和miR-29c過表達陰性對照組（封三圖1B）的凋亡率分別為（14.830±3.186）%、（15.414±1.358）%;miR-29c過表達組（封三圖1C）的細胞凋亡率為（32.190±9.254）%，與空白對照組、miR-29c過表達陰性對照組比較，其差異明顯（P<0.05）;miR-29c抑制表達組（封三圖1E）的細胞凋亡率為（7.830±2.984）%，其陰性對照組（封三圖1D）的細胞凋亡率為（15.102±3.301）%，差異明顯（P<0.05）。說明miR-29c能促進經TNF-α誘導的HUVECs凋亡。

2.6 miR-29c對Akt磷酸化（p-Akt）、eNOS磷酸化（p-eNOS）及eNOS蛋白表達的影響

空白對照組、miR-29c過表達陰性對照組、miR-29c過表達組、miR-29c抑制表達陰性對照組、miR-29c抑制表達組分別轉染HUVECs，再用10 ng/mL的TNF-α誘導HUVECs 48 h，相對于空白對照組和陰性對照組，miR-29c過表達組的Akt磷酸化（p-Akt）和eNOS磷酸化（p-eNOS）表達明顯下調（P<0.05）;相對于陰性對照組，miR-29c抑制表達組的Akt磷酸化（p-Akt）和eNOS磷酸化（p-eNOS）表達明顯上調（P<0.05），對eNOS蛋白表達無影響，說明miR-29c可抑制經TNF-α誘導的HUVECs中Akt及eNOS磷酸化，見表8。

2.7 miR-29c對經TNF-α誘導的HUVECs NO釋放量的影響

空白對照組、miR-29c過表達陰性對照組、miR-29c過表達組、miR-29c抑制表達陰性對照組、miR-29c抑制表達組分別轉染HUVECs，再用10 ng/mL的TNF-α誘導HUVECs 48 h，分別取培養液100 μL，以硝酸還原酶法檢測NO濃度，進而評估HUVECs NO釋放量，結果顯示，相對于空白對照組和miR-29c過表達陰性對照組，miR-29c過表達組NO釋放量明顯下降（P<0.05）;相對于其陰性對照組，miR-29c抑制表達組NO釋放量明顯增加（P<0.05），說明miR-29c可降低經TNF-α誘導的HUVECs中NO的釋放量，見表9。

3 討論

血管內皮細胞在維持機體內環境穩定的過程中發揮著舉足輕重的作用，Lee HY[10]、Guo F[11]等發現TNF-α可通過激活HUVECs從而誘導HUVECs的凋亡，進而提升血管通透性和引發白細胞浸潤及一系列的炎癥反應。為摸索TNF-α離體作用時間及濃度，采用MTT法檢測TNF-α的誘導對血管內皮細胞增殖活力的影響，結果顯示10 ng/mL的TNF-α處理HUVECs 48 h，細胞的增殖活力明顯降低，從而建立起TNF-α誘導的HUVECs凋亡模型。

有研究表明，在動脈粥樣硬化形成過程中血管內皮細胞可產生TNF-α，其通過與敏感靶細胞結合引發內皮細胞的凋亡和壞死[12]。Hu Y等[9]研究發現HUVECs中miR-29c的表達與TNF-α的誘導可能存在關聯，故實驗采用qRT-PCR法檢測TNF-α誘導HUVECs后miR-29c表達的變化，結果顯示miR-29c的表達隨TNF-α誘導呈時間及劑量依賴性的增加，即miR-29c的表達與TNF-α的誘導呈正相關。

內皮細胞的瞬時轉染和效率評估是研究結果準確度的基礎。本研究采用化學合成的miRNA mimics瞬時轉染HUVECs。然后用MTT法檢測miR-29c mimics對血管內皮細胞增殖活力的影響來評估轉染效果。結果發現50 nmol/L的miR-29c mimics作用細胞48 h后，細胞增殖活力明顯下降，有效地篩選出了miRNA成熟體模擬物轉染的最佳轉染條件。

研究表明miR-155、miR-221、miR-222、miR-29c和miR-126等多種miRNAs是血管內皮細胞損傷的調節因子，其參與維持血管內皮細胞生物學功能的調節[13-15]。Liu L等[16]研究發現miR-29c靶向抑制VEGFA的表達，促進HUVEC的血管形成，是肺腺癌的潛在治療靶標，提示miR-29c參與調控HUVEC的相關生物學功能;Hu Y等[9]研究發現miR-29c表達于HUVECs，參與調節HUVECs的增殖和血管形成等，暗示miR-29c可能參與HUVECs損傷及動脈粥樣硬化發生發展的調節。然而在TNF-α誘導的血管內皮細胞的增殖與凋亡中，miR-29c是否參與其調控尚未可知。故將miR-29c mimics和inhibitor分別轉入TNF-α誘導的HUVECs中。結果發現miR-29c過表達明顯下調HUVECs增殖活力，促進經TNF-α誘導的HUVECs凋亡，而miR-29c抑制表達則出現相反趨勢的結果。

早期研究發現，AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對細胞增殖、分化和凋亡具有重要調控作用，與動脈粥樣硬化、糖尿病及癌癥等疾病密切相關[17-18]。eNOS主要分布于血管內皮細胞，是機體內NO產生的關鍵酶，可促使內皮源性舒血管因子NO的釋放[19-20]。也有研究表明AKT信號旁路的激活參與了eNOS磷酸化而產生內皮源性NO，使血管舒張[21]。NO能抑制內皮素等縮血管物質分泌，并具有抑制血小板聚集、抑制黏附因子表達及清除氧自由基等作用，從多個環節抑制血管內皮細胞凋亡，是重要的內源性抗動脈粥樣硬化因子[22-23]。因此，探索miR-29c對p-Akt、p-eNOS、eNOS蛋白表達的影響，有益于闡明miR-29c抑制經TNF-α誘導的HUVECs的增殖及促進其凋亡的分子機制。本研究檢測miR-29c對HUVECs p-Akt、p-eNOS、eNOS蛋白表達的影響，結果發現miR-29c過表達可顯著下調p-Akt、p-eNOS磷酸化，抑制表達miR-29c能顯著上調p-Akt、p-eNOS磷酸化，而對eNOS蛋白的表達無影響，同時檢測培養液中NO的含量，發現miR-29c可降低經TNF-α誘導的HUVECs中NO的釋放量。

綜上所述，miR-29c可顯著抑制經TNF-α誘導的HUVECs的增殖及促進其凋亡，其機制可能與下調p-Akt、p-eNOS磷酸化，進而抑制NO釋放有關，為進一步闡明AS的發生發展機制及防治該疾病提供了新依據。

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（收稿日期：2019-08-21）