錯配修復蛋白在結直腸癌中的表達及臨床意義分析

張如意（通訊作者） 姚秀娟

（1浙江大學醫學院附屬第二醫院病理科 浙江 杭州 310009）

（2嘉興市第二醫院病理科 浙江 嘉興 314000）

結直腸癌是位居第3位的常見惡性腫瘤，其發病率逐年升高。結直腸癌至少起源于兩條不同的遺傳途徑。其中一條途徑與染色體不穩定（CIN）有關，另一條與微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）有關[1]。MSI顯示出MMR缺失，故將其作為一種分子標記。MMR起穩定DNA的作用，在體細胞分裂時參與修復DNA復制過程中產生的特定復制錯誤。MSI腫瘤由于MMR缺陷，產生突變加速累積。結直腸癌中大約15%是由微衛星不穩定途徑形成的， DNA復制過程中錯配修復（mismatch repair，MMR）基因系統異常是MSI發生的原因[2]。MSI與DNA修復蛋白的表達減少有關，通常使用免疫組織化學檢測MLH1，MSH2，MSH6和PMS2作為MSI標記。

在散發性結直腸癌中檢測MMR可作為HNPCC初篩，并且可對指導治療方案和預后方面具有重要意義。Dung T. Le等在2015年發現，傳統治療效果不理想的伴微衛星不穩定的結直腸癌晚期患者，在使用PD1抑制劑pembrolizumab時取得了驚人的效果，使得這類患者可接受腫瘤免疫治療，因此開展結直腸癌MMR檢測具有重要的臨床意義[3]。本研究采用免疫組織化學方法對90例連續的結直腸癌患者檢測MSH2、MSH6、MLH1和PMS2蛋白的表達，并觀察其臨床病理學意義。

1.材料和方法

1.1 材料

收集2016年—2017年嘉興市第二醫院病理科診斷為結直腸癌的病例90例。所有病例均經兩位病理醫師復診。其中男性60例，女性30例，年齡30～88歲。左半結腸癌23例，右半結腸癌21例，直腸癌46例。71例高分化及中分化，19例低分化。浸潤深度17例未達漿膜，73例侵及漿膜。29例有淋巴結轉移，61例無淋巴結轉移。

1.2 方法

組織學和免疫組化染色：標本均經10%中性緩沖福爾馬林固定，常規脫水、石蠟包埋，連續切片，厚3～4μm，進行常規HE及免疫組化EnVision兩步法染色，檢測MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白表達，所有抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 結果判定

MMR蛋白定位于細胞核，細胞核著色判定為陽性，與染色強弱以及陽性細胞彌漫或局灶分布無關。細胞核不著色則判定為陰性。

1.4 統計學分析

實驗數據采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 MLH1、MSH2、MSH6和PMS2免疫組織化學表達缺失

對90例結直腸癌樣本進行MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白免疫組織化學檢測。MMR蛋白檢測可出現4種異常蛋白丟失表達方式，即MLH1-PMS2-、MSH2-MSH6-、MSH6-和PMS2-。本研究90例結直腸癌中，11例發生MMR蛋白丟失表達（圖1），其中8例MLH1-/PMS2-，1例MSH2-/MSH6-，2例PMS2-，以MLH1和PMS2蛋白表達缺失為主。MSH2、MSH6、MLH1、PMS2蛋白表達缺失率分別為1.1%（1/90）、1.1%（1/90）、8.9%（8/90）、11.1%（10/90）。

2.2 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達與結直腸癌臨床病理特征的相關分析（表1）

表1 MMR蛋白缺失表達與臨床病理因素分析

結直腸癌組織中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達缺失與患者年齡、性別、浸潤深度、淋巴結轉移無關（P＞0.05），缺失表達發生于右半結腸高于左半結腸和直腸（P=0.04），蛋白表達缺失與組織學分化高低相關（P=0.03）。

圖1 直腸癌組織HE染色及MMR蛋白的陽性表達（定位在細胞核）

3.討論

50～85%結直腸癌是由染色體不穩定途徑發展而來，DNA錯配修復引起MSI約占10～20%[2]。將一個錯配修復基因如MLH1或MSH2敲除后導致遺傳突變，引起的HNPCC占CRC少于5%。MSI通常是由于MLH1啟動子散發性甲基化沉默引起[4]。本研究中dMMR在CRC中占12.2%（11/90），缺失表達發生于右半結腸高于左半結腸和直腸（P=0.04），蛋白表達缺失與組織學分化高低相關（P=0.03），這一數據與現有報道相比較一致。

本研究中不同MMR蛋白的缺失模式與其他報道相似，其中MLH1和PMS2最多，占的dMMR的72.7%。這一比率與其他報道相似。MLH1和PMS2同時缺失導致MLH1缺失突變和MLH1啟動子散在甲基化沉默，其他的dMMR蛋白缺失僅與各自的DNA修復基因突變有關。MMR翻譯時，有必要考慮MMR的二聚體關系。MSH2和MSH6結合形成MutSα異二聚體，識別并結合至錯配堿基對，并且引起MLH1和MSH2結合形成的MutLα異二聚體修復錯配堿基對。在MutLα和MutSα中，MLH1和MSH2是必須蛋白，而PMS2和MLH1是其相應的結合配體蛋白。MLH1和MSH2是PMS2和MSH6穩定所必須，MLH1或MSH2的缺失將引起其各自結合配體蛋白降解。相反，配體蛋白缺失并不影響必須蛋白，后者可與替代的次要蛋白結合成異二聚體[5]。因此，單獨缺失PMS2和MSH6最可能引起各自錯配基因的缺失突變。

2016年美國ASCO年會報告，腫瘤部位與Ⅲ∕Ⅳ期結直腸癌獨立的預后有關，右半結腸相較于左半結腸和直腸死亡風險明顯增高。本研究結果顯示MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達缺失與患者年齡、性別、浸潤深度、淋巴結轉移無關（P＞0.05），缺失表達發生于右半結腸高于左半結腸和直腸（P=0.04），也提示MMR蛋白表達狀態與結直腸癌預后相關。

MMR缺失患者對5-氟尿嘧啶的輔助治療效果不佳[6]。傳統治療效果不理想的伴微衛星不穩定的結直腸癌晚期患者，在使用PD1抑制劑pembrolizumab時取得了驚人的效果，使得這類患者可接受腫瘤免疫治療[3]。綜上所述，開展結直腸癌MMR檢測對于判斷預后及尋找有效治療方法，具有重要的臨床意義。