電針對局灶性腦缺血大鼠缺血皮質區內皮抑素、血小板反應蛋白-1表達的影響

李斯亮，唐 巍，龔 麗，昝興淳，豐麗媛，童明月，何 鵬

(1.安徽中醫藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學針灸推拿學院，安徽 合肥 230012)

缺血性腦卒中可產生臨床各種神經功能缺失的癥狀，是由于局部腦組織血液供應障礙，腦組織缺血低氧性病變壞死所致[1]。該病發病率、病死率高，每年導致約670萬人死亡[2]。85歲以上老人發生腦卒中的概率約為25%，缺血性腦卒中約占80%[3]。近年來有研究表明，腦梗死周圍皮質的血管生成作用可在一定程度上促進腦卒中后神經功能恢復[4]。電針可增加梗死區腦血流量、血管數量，并改善神經功能[5]。過去很多報道著眼于減少腦缺血性疾病的損害因素[6]，然而臨床療效并不理想，因此尋求新的方法成為研究的重點。有文獻報道通過抑制內皮抑素(endostatin，ES)、血小板反應蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)等抑制因子對血管新生的負向調節，能夠改善腦缺血損傷后腦血管生成效應，增加缺血區及其周圍血液供應，使受損神經得到修復[7]，這可能成為臨床通過調控血管新生抑制因子促進腦缺血后血管新生，發揮腦保護作用的新途徑。本研究以電針與血管新生抑制因子表達的關聯性作為切入點，探討電針療法能否通過調控血管新生抑制因子的表達，促進神經功能的改善，產生腦保護作用。

1 材料

1.1 動物 健康的雄性SD大鼠54只，體質量為280～320 g，由安徽醫科大學動物飼養中心[生產許可證號為SCXK(皖)2011-002]提供。每籠飼養3只，室溫控制在20～25 ℃，保持通風，動物在自然條件下飲食飲水，術前禁食不禁水。

1.2 試劑 ES、TSP-1抗體：武漢Abcam公司；SABC試劑盒：武漢博士德公司；SP二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司；TTC染色液：美國Sigma公司；ECL顯影劑：Bio-rad公司；SDS：Sigma公司。

1.3 儀器 華佗牌毫針、華佗牌SDZ-Ⅳ型電子針療儀(0.30 mm×25 mm)：蘇州醫療用品廠有限公司；石蠟組織薄片切片機：德國LEICA公司；BX51型Olympus顯微鏡：日本Olympus公司；垂直板電泳槽(24DN型)：北京六一儀器廠；EPS300型電泳儀：上海天能科技有限公司。

2 方法

2.1 干預方法 依據《實驗針灸學》[8]進行穴位定位，電針組大鼠取“百會”和“水溝”穴進行治療。“百會”穴取于頂骨正中，沿皮向前平刺1 cm；“水溝”穴取于唇裂鼻尖下1 mm正中，沿鼻中隔方向斜刺0.3～0.4 cm。于術后4 h開始刺激，采用0.30 mm×25 mm毫針針刺，接SDZ-Ⅳ華佗電針治療儀。電針參數為疏密波，電流強度為1 mA，頻率為2 Hz。每次時間30 min，每日1次，連續治療7 d。

2.2 動物分組及模型制備 54只大鼠分為假手術組、模型組、電針組，每組18只。參照LONGA等[9]改良的頸外動脈線栓法復制局灶性大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型：大鼠術前禁食不禁水，用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉(10 mL/kg)，仰臥位固定于鼠板，無菌操作。用手術剪在頸部正中靠右0.5 cm處縱向剪一道長約2 cm的切口，血管鉗鈍性分離，暴露右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)和迷走神經。向下剝離出頸內動脈(internal carotid artery，ICA)和頸外動脈(external carotid artery，ECA)，用縫合線在ECA上打死結并將其在遠心端凝斷，使ECA的游離端與ICA拉成一條直線，動脈夾暫時夾閉備用線遠端的ICA和CCA。在ECA根部用縫合線打一松結，再用眼科剪在ECA殘端斜45°方向剪一小口，將適合于大鼠體質量標記好的魚線插入ICA并沿入顱方向徐徐推入，插入深度18～20 mm，稍遇阻力應立即停止插線。將ECA根部預留好的縫合線打死結固定好，移去動脈夾，縫合切口皮膚，常規無菌操作后注射0.5 mL青霉素鈉，預防感染。其中假手術組不插入栓線，僅作各動脈分離。大鼠清醒后自由進食、進水，每日更換墊料，保持籠具清潔，注意保溫。依據神經功能學評分判斷大鼠模型是否復制成功[10]，模型復制成功的標準：對側前爪彎曲，伸展受限；自主運動時，身體向偏癱側轉圈或者身體向對側傾倒。

2.3 神經功能學評分 參照文獻[11]制定神經功能評分標準。于大鼠清醒后評分。0分：大鼠自主活動無異常；1分：大鼠左側前肢伸展不全；2分：大鼠醒后運動時，向癱瘓側轉圈；3分：大鼠醒后運動時，身體向左側傾倒；4分：意識喪失，不能自發行走。

2.4 指標觀察方法

2.4.1 大鼠神經功能評分 參考神經功能學評分標準，于治療7 d后對各組大鼠進行神經功能缺損評分。

2.4.2 大鼠腦梗死面積檢測 利用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-Triphenyte-trazoliumchloride，TTC)染色法進行觀察。大鼠評分結束立刻予以腹腔深度麻醉處死，快速取完整腦組織置于冰袋上，用生理鹽水沖凈后立即置于培養皿中，切除小腦和嗅球。放入-20 ℃冰箱10～15 min冰凍，取出后進行冠狀面切片，共5片，每片厚度為2 mm。加入2% TTC染色液，于37 ℃水浴箱中避光溫育30 min，4 ℃環境下用4%多聚甲醛固定。將腦片取出擺放好，用數碼相機照像。用圖像分析系統Image Pro-Plus 6.0測量腦梗死面積，腦梗死面積百分比=梗死面積/全腦片面積×100%。

2.4.3 大鼠腦缺血皮質區ES、TSP-1蛋白表達水平檢測 用4%多聚甲醛將全腦固定過夜，1周后取出，經過脫水、浸蠟、包埋、切片、攤片、烤片及脫蠟等步驟，采用免疫組織化學法對腦組織中ES、TSP-1蛋白表達水平進行檢測。隨機選取7張非連續的腦組織切片，在400倍光鏡下觀察缺血梗死部位，采用Image pro-plus 6.0圖像處理系統計平均光密度，以胞漿棕黃色為陽性表達。

2.4.4 大鼠腦缺血皮質區ES、TSP-1蛋白相對表達水平檢測 采用Western blot法進行測定。用RIPA裂解液提取蛋白，按照1∶4加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。ES、TSP-1分別進行10% SDS-PAGE、15% SDS-PAGE變性電泳，轉膜后再用TBST(含5%脫脂奶粉)封閉，而后進行一抗孵育、二抗孵育。TBST洗膜后，參照ECL發光試劑盒說明書依次進行化學發光、顯影、定影。用Image J軟件計算內參條帶與目標條帶的凈吸光度值，最終得出目標條帶與內參條帶凈吸光度值的比值作為蛋白相對表達水平。

3 結果

3.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 假手術組大鼠無明顯神經功能缺損癥狀，評分為0分；與假手術組比較，模型組大鼠神經功能缺損癥狀較為明顯；與模型組比較，電針組大鼠經電針干預后神經功能缺損評分明顯降低(P<0.05)。結果提示電針療法可有效提高腦缺血大鼠的神經功能。見圖1。

3.2 各組大鼠腦梗死面積比較 經TTC染色觀察發現，假手術組未見明顯缺血區域，模型組右側腦半球出現蒼白色缺血區域。經過計算梗死面積發現，與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死區域明顯；與模型組比較，電針組大鼠梗死面積顯著減小(P<0.05)。見圖1、圖2。

3.3 各組大鼠腦缺血皮質區ES、TSP-1陽性細胞平均光密度比較 與假手術組比較，模型組大鼠腦缺血皮質區ES、TSP-1陽性細胞平均光密度明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，電針組ES、TSP-1陽性細胞平均光密度明顯降低(P<0.05)。見圖3、圖4。

注：A.假手術組；B.模型組；C.電針組；與模型組比較，△P<0.05；神經功能缺損評分，n=18;腦梗死面積,n=6

圖2 各組大鼠腦梗死區域大體形態(TTC染色)

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

3.4 各組大鼠腦缺血皮質區ES和TSP-1蛋白表達水平比較 假手術組大鼠腦缺血皮質區ES、TSP-1蛋白有少量表達；與假手術組比較，模型組大鼠ES、TSP-1蛋白表達水平顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，電針組ES、TSP-1蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。見圖5。

4 討論

腦缺血屬中醫學“中風”范疇。其病機可歸納為風、火、痰、氣、虛、瘀，機體可在此6種病因影響下導致陰陽失調，氣血逆亂，上犯于腦而發病。針刺作為傳統中醫療法，具有操作簡便、安全的特點，在腦缺血治療及其后遺癥預防方面卓有成效?！鞍贂睘槭肿闵訇?、足太陽、足厥陰與督脈之會，有疏通腦絡、協調百脈、補神益智之效?！八疁稀毕刀矫}穴，為督脈與手足陽明經的交會穴，可開竅啟閉、調督醒神。實驗研究證實，針刺“百會”“水溝”可發揮對腦缺血后損傷的修復作用[12-14]。故本實驗選取此二穴對MCAO模型大鼠進行電針干預，探討其相關作用機制。

圖4 各組大鼠腦缺血皮質區ES、TSP-1陽性細胞表達比較(免疫組織化學法，10×40倍，箭頭示陽性細胞)

注：A.假手術組；B.模型組；C.電針組；與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

腦缺血發生后，腦血管內皮細胞的損傷可導致血腦屏障功能障礙，降低其通透性，形成腦水腫；腦水腫可進一步損傷缺血區的神經細胞[15]。文獻報道，新生的腦微血管可改善缺血區周圍的血流灌注，為修復神經細胞提供良好的微環境，改善腦缺血后的神經功能[16]。

研究發現，ES是目前已知最強的內源性血管生成抑制因子，能特異性作用于血管內皮細胞，誘導血管內皮細胞凋亡，抑制遷移活動，從而抑制血管再生[17]。ES主要在一些高度血管化的組織(如腦的脈絡膜、腸壁血管)中表達，并參與血管周邊基質的結構和組裝[18]，在正常腦組織呈低表達，腦缺血損傷后主要表達在海馬、側腦室周圍、紋狀體等部位，并于腦缺血后2 h增加，12 h達高峰[19]。另有研究發現，ES可導致血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與其受體的結合減少，抑制VEGF介導細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)酪氨酸磷酸化，從而抑制VEGF誘導的新血管形成作用[20]。TSP-1是一種血管生成抑制因子[21]，主要通過刺激炎性因子和DR相關基因的表達誘導一氧化氮合酶等效應蛋白的表達來發揮作用，可抑制纖維生長因子或VEGF誘導的血管生成反應，通過多種途徑抑制內皮細胞的黏附，阻礙其遷移[22]。VEGF是目前發現的最強烈的血管新生促進因子[23]。研究表明，通過上調梗死區VEGF的表達、下調ES的表達有利于血管新生，可改善缺血區周圍血流灌注，促進神經細胞修復。資料顯示，腦缺血損傷修復的關鍵之一是調整ES和VEGF兩者之間的動態平衡[24]，而電針下調TSP-1的表達亦可對腦缺血損傷起到修復作用[25]。

本實驗結果表明，電針干預可明顯改善大鼠神經功能，有效降低缺血區梗死面積，同時可伴有血管新生抑制因子ES、TSP-1蛋白表達下降。電針干預能夠抑制ES、TSP-1等血管新生抑制因子對血管新生的負反饋調節，從而發揮VEGF等血管新生促進因子的血管生成作用，修復受損神經，減輕腦缺血后腦神經的損傷。

綜上所述，電針“百會”和“水溝”穴可顯著下調MCAO模型大鼠腦缺血皮質區血管新生抑制因子ES、TSP-1蛋白表達，這對于促進神經功能恢復，縮小缺血區梗死面積，具有一定的臨床價值，可能是其發揮腦缺血后腦功能保護作用的機制之一。而ES、TSP-1對缺血性腦卒中后血管新生的作用機制尚未明確，有待于進一步研究。