基于PTEN研究桃紅四物湯治療產后血瘀證的機制

湛宇燦，韓曉靜，李白坤，蘇婧婧，劉竹青，劉瑞山，朱繼民

(1.安徽中醫藥大學中西醫結合學院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫藥大學科研實驗中心，安徽 合肥 230038；4.安徽中醫藥大學針灸推拿學院，安徽 合肥 230012；5.安徽醫科大學公共衛生學院，安徽 合肥 230032)

新產后、流產后及產褥期發生的與分娩或產褥有關的疾病統稱為產后病[1]。臨床上產后病以血瘀證多見。桃紅四物湯對婦科血瘀證療效顯著[2-3]，表現出“祛瘀”與“生新”雙重功效，其作用機制可能與Ras同源基因/Rho激酶(Ras homolog gene/Rho kinase，Rho/ROCK)信號通路[3-4]以及磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase，PI3K/Akt)信號通路等有關[2,5]。第10染色體缺失的堿性磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted in chromosome 10，PTEN)介于Rho/ROCK與PI3K/Akt通路之間，在細胞生長、分化、凋亡、遷移等方面起著重要的調控作用[6-8]。故推測桃紅四物湯治療產后血瘀證的作用機制可能與PTEN有關。

1 材料

1.1 動物 10月齡SPF級健康SD大鼠100只，其中雌性70只，雄性30只，體質量220～250 g，由上海杰思捷實驗動物有限公司[實驗動物生產許可證號為SCXK(滬)2013-0006]提供，常規飼養。本實驗獲得安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物 益母草顆粒(批號 170107)：廣西禪方藥業有限公司；米非司酮片(批號 151201)：湖北葛店人福藥業有限公司；米索前列醇(批號 43160403)：華潤紫竹藥業有限公司。桃紅四物湯(桃仁、當歸、白芍各9 g，紅花、川芎各6 g，熟地黃12 g)飲片：安徽省合肥樂家老鋪中藥飲片有限公司。參照文獻[9]方法，將桃紅四物湯飲片加入10倍量[容積(L)/質量(kg)]75%的乙醇，冷凝回流提取2 h后，倒出藥液，然后用8倍量75%的乙醇，冷凝回流提取2 h，合并兩次提取液，濃縮至生藥含量為1.8 g/mL的提取液。

1.3 主要試劑 PTEN抗體：美國Cell Singling Technology公司；β-actin抗體：Sigma公司；山羊抗兔IgG/HRP及山羊抗小鼠IgG/HRP：北京中杉金橋生物技術有限公司；化學發光法試劑盒：美國Thermo Fisher公司；TRIzol?試劑：美國Invitrogen公司；擴增試劑盒RR820A、逆轉錄試劑盒RR047A：Takara公司。PTEN PCR上游引物為5′-ATGTTCAGTGGCGGAACTTG-3′，下游引物為5′-GTCACCACACACAGGCAATG-3′。

1.4 主要儀器 LEICA EG 1150 H石蠟包埋機：德國Leica公司；LEICA RM2135切片機：湖北孝感市泰維電子有限公司；CK2型倒置顯微鏡：日本Olympus公司；AllegraTM25R臺式高速冷凍離心機：美國Beckman Coulter公司；ViiA7熒光定量PCR儀：美國ABI公司；電泳-轉印系統：美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 模型復制 適應性飼養1周后，隨機留取8只雌性大鼠作為正常對照組，其余大鼠于20∶00以2∶1的比例將雌鼠與雄鼠合籠，次日晨進行陰道栓和陰道涂片鏡檢，發現陰道栓和精子的當天為妊娠的第1天。于妊娠第7天分別灌胃米非司酮(8.3 mg/kg，8∶00)和米索前列醇(0.1 mg/kg，18∶00)，給藥米索前列醇后向大鼠陰道塞入適合大小的棉球。次日8∶00和20∶00取出棉球，若觀察到棉球上有血則判定為早孕大鼠藥物流產[10]。大鼠流產第2天從眼內眥取血，肝素抗凝后，檢測血液流變學指標的變化。若全血黏度低切(1 s-1)≥45 mPa·s、高切(200 s-1)≥4.5 mPa·s則為血液流變性異常，判定為產后血瘀證[2]。

2.2 分組與給藥 選取模型復制成功的大鼠40只，隨機分為5組，即模型組(給予蒸餾水灌胃)，陽性對照組(給予益母草顆粒4.3 g/kg灌胃)，桃紅四物湯低劑量(4.5 g/kg，相當于成人臨床用量的5倍)、中劑量(9.0 g/kg)、高劑量(18.0 g/kg)組，每組8只。正常對照組給予蒸餾水灌胃。大鼠自由飲食，灌胃容積為10 mL/kg，每日2次，連續7 d。

2.3 子宮組織采集 末次給藥1 h后，用3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取出子宮組織拍照后，取其中一半用10%多聚甲醛固定，經過脫水、石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，觀察大鼠的子宮形態學改變；另一半子宮組織于-80 ℃凍存，用于PTEN mRNA及PTEN蛋白檢測。

2.4 PTEN mRNA檢測 從凍存管中取0.1 g子宮組織，冰水浴中研磨均勻，加入1 mL Trizol按說明書提取子宮RNA。260 nm/280 nm下測定純度，滿意后取樣品RNA 5 μg進行逆轉錄合成cDNA。按說明書配制總容積為20 μL的實時PCR反應體系。反應條件：95 ℃ 1 min；42個PCR循環(95 ℃，10 s；60 ℃，30 s；72 ℃，1 min)。采用2-ΔΔCt法(ΔCt=待測樣品目的基因Ct值-待測樣品內參的Ct值；ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組ΔCt)[11]計算各組大鼠子宮組織的PTEN mRNA相對表達水平。

2.5 PTEN蛋白檢測 取各組大鼠子宮組織，加裂解液后冰上裂解、研磨，4 ℃下12 000 r/min離心后取上清，考馬斯亮藍法蛋白定量。煮沸變性、電泳分離后，采用濕轉法轉印至聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉PBST緩沖液室溫封閉2 h，加PTEN單抗(1∶500)，4 ℃過夜。過夜后PBST洗膜3次，每次10 min，然后與結合有辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBS洗膜3次，每次10 min，按照ECL化學發光試劑盒使用說明書檢測蛋白表達水平，并使用凝膠成像系統記錄拍照，Image J檢測各條帶平均灰度值，以目的蛋白灰度值與內參灰度值之比作為目的蛋白的相對表達水平。

3 結果

3.1 桃紅四物湯對大鼠子宮形態的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠子宮色澤較暗，有水腫感，各給藥組子宮的色澤較模型組紅潤。見圖1。HE染色后光鏡下觀察發現：正常對照組子宮內膜腺體較大，間質無水腫，無充血，管腔內無紅細胞聚集；模型組子宮內膜腺體較小，間質稍顯水腫，有充血，管腔內有紅細胞聚集；各藥物組子宮間質充血和水腫等“血瘀證”表現較模型組減輕。見圖2。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.陽性對照組；D.桃紅四物湯低劑量組；E.桃紅四物湯中劑量組；F.桃紅四物湯高劑量組

圖1各組大鼠子宮的大體形態

注:A.正常對照組;B.模型組;C.陽性對照組;D.桃紅四物湯低劑量組;E.桃紅四物湯中劑量組;F.桃紅四物湯高劑量組圖2 光鏡下各組大鼠子宮的組織形態學變化(HE染色,10×10倍)

3.2 桃紅四物湯對大鼠子宮PTEN mRNA表達水平的影響 與正常對照組比較，模型組PTEN mRNA表達水平顯著升高(t=-2.413，P=0.037)；除正常對照組外，單因素方差分析顯示其他5組PTEN mRNA表達水平的差異有統計學意義(F=3.946，P=0.047)；均數多重比較發現，僅桃紅四物湯高劑量組PTEN mRNA表達水平顯著低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠子宮PTEN mRNA相對表達水平比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 桃紅四物湯對大鼠子宮PTEN蛋白表達水平的影響 與正常對照組比較，模型組PTEN蛋白表達水平顯著升高(t=-2.134，P=0.048)；除正常對照組外，單因素方差分析顯示其他5組PTEN蛋白表達水平的差異有統計學意義(F=3.931，P=0.049)；均數多重比較發現，桃紅四物湯高、中劑量組PTEN表達水平均顯著低于模型組(P<0.05)。見圖3與圖4。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.陽性對照組；D.桃紅四物湯低劑量組；E.桃紅四物湯中劑量組；F.桃紅四物湯高劑量組

圖3 Western blot法檢測大鼠子宮PTEN蛋白表達水平

注：A.正常對照組；B.模型組；C.陽性對照組；D.桃紅四物湯低劑量組；E.桃紅四物湯中劑量組；F.桃紅四物湯高劑量組；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

桃紅四物湯能顯著改善產后血瘀狀態[2-3,12]，但桃紅四物湯祛瘀生新的作用機制尚未完成闡明。文獻研究提示，介于Rho/ROCK與PI3K/Akt通路之間的PTEN，可能會在桃紅四物湯祛瘀生新中發揮橋梁作用[4-6]。本研究率先探索桃紅四物湯治療產后血瘀證的作用機制與PTEN的關聯性。

研究結果顯示，桃紅四物湯對產后血瘀證有良好治療作用，桃紅四物湯低、中、高劑量組大鼠子宮充血、水腫等“血瘀”狀態較正常對照組明顯減輕，桃紅四物湯中、高劑量組的作用更為顯著。本研究發現，模型對照組大鼠子宮組織PTEN mRNA和蛋白表達水平較正常對照組顯著升高(P<0.05)，各給藥組大鼠子宮組織PTEN mRNA和蛋白的表達水平較模型組明顯下降，其中桃紅四物湯高劑量組PTEN mRNA和蛋白的表達水平與模型組的差異均有統計學意義(P<0.05)。研究結果與預期實驗結果基本一致，即桃紅四物湯治療產后血瘀的機制可能與其減少Rho/ROCK信號通路下游PTEN的表達，從而減弱PTEN對PI3K/Akt通路的抑制作用，進而促進內皮細胞增殖等有關[13]。

中醫認為血瘀是婦科疾病最主要的病因，產后血瘀不僅是一種病證也是其他疾病的病因，桃紅四物湯是祛瘀生新的代表方，祛瘀為本，輔以行氣活血，其中桃仁、紅花散瘀活血，當歸、熟地黃滋陰養血，白芍養血，川芎調暢氣血、行氣活血。臨床研究表明，桃紅四物湯對婦科血瘀證有明顯的治療作用[12,14]。

本研究主要從分子生物學的角度初步探討桃紅四物湯對產后血瘀大鼠的祛瘀生新作用機制是否與PTEN有關。研究發現，桃紅四物湯能改善產后血瘀大鼠子宮的血瘀狀態，且可能影響PTEN mRNA及PTEN蛋白的表達，提示桃紅四物湯對產后血瘀大鼠祛瘀生新的作用機制可能與抑制PTEN蛋白及其基因表達有關。